Г у р: Страница не найдена

Дофаминергические нейроны иннервируют обширные области мозга и выделяют дофамин (DA) на широкий спектр целевых нейронов.Однако выпуск DA также точно регулируется. В препаратах эксплантатов мозга Drosophila melanogaster DA выделяется специфически на α3 / α’3-компартменты нейронов грибовидного тела (MB), которые случайно активируются холинергическими и глутаматергическими входами. Механизм этого точного выпуска неясен. Это исследование показало, что случайно активированные нейроны MB генерируют монооксид углерода (CO), который действует как ретроградный сигнал, вызывающий локальное высвобождение DA из пресинаптических окончаний.Продукция CO зависит от активности гемоксигеназы в постсинаптических нейронах MB, а вызванное CO высвобождение DA требует оттока Ca (2+) через рианодиновые рецепторы в DA терминалах. CO образуется только в областях MB, получающих совпадающую активацию, а удаление CO с помощью поглотителей блокирует высвобождение DA. Предполагается, что нейроны DA используют два различных режима передачи для создания глобальной и локальной передачи сигналов DA (Ueno, 2020).

Дофамин (DA) необходим для различных функций мозга, включая регуляцию глобальных состояний мозга, таких как возбуждение и настроение.Для выполнения этих функций отдельные нейроны DA иннервируют обширные области мозга и высвобождают DA в широкий спектр целевых нейронов посредством процессов, известных как объемная передача. Однако эта обширная иннервация не подходит для точного, локализованного высвобождения DA, и было неясно, насколько широко иннервирующие дофаминергические нейроны могут также направлять высвобождение DA на определенные нейроны-мишени (Ueno, 2020).

У дрозофилы обонятельные ассоциативные воспоминания формируются и хранятся в грибовидных телах (МБ), где клетки Кеньона, внутренние нейроны МБ, активируемые различными запахами, образуют синаптические связи с различными выходными нейронами МБ, которые регулируют поведение приближения и избегания.Дофаминергические нейроны (DA нейроны) модулируют пластичность синапсов между клетками Кеньона и выходными нейронами MB. Однако, хотя существует ~ 2000-2500 клеток Кеньона, которые формируют тысячи синапсов с нейронами, выводящими MB, пластичность в этих синапсах регулируется относительно небольшим числом DA нейронов. Это указывает на то, что каноническое высвобождение, зависящее от потенциала действия, не может полностью объяснить высвобождение и пластичность DA. Недавно было установлено, что у Drosophila экзоцитоз синаптических везикул (SV) от DA-терминалов ограничен нейронами MB, которые были активированы совпадающими входами от активируемых запахом холинергических путей и глутаматергических путей, которые передают соматосенсорную (болевую) информацию.Информация об запахе передается в MB проекционными нейронами из антеннальной доли (AL), в то время как соматосенсорная информация передается в мозг через восходящие волокна вентрального нервного канатика (AFV). Стимуляция AL вызывает ответы Ca2 + в МБ за счет активации nAChR, а стимуляция AFV вызывает ответы Ca2 + в МБ путем активации рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDAR) в МБ. Важно отметить, что когда AL и AFV стимулируются одновременно (AL 1 AFV) или AL и NMDAR стимулируются одновременно (AL 1 NMDA), возникает пластичность, так что последующие стимуляции AL вызывают повышенные ответы Ca 2+ в компартментах a3 / a93.Эта пластичность известна как долгосрочное усиление (LTE) ответов MB и требует активации DA рецепторов D1 типа (D1R) в MB. Более того, хотя активации только D1R достаточно для продуцирования LTE, ни AL, ни стимуляция AFV сами по себе не способны вызывать экзоцитоз SV из пресинаптических DA-окончаний, проецируемых на a3 / a93 отсеки вертикальных долей MB. Вместо этого экзоцитоз от DA-концов происходит только тогда, когда постсинаптические клетки Kenyon активируются совпадающей стимуляцией AL 1 AFV или AL 1 NMDA.Поразительно, в то время как MB являются двусторонними структурами и DA нейроны проецируют терминалы на обе стороны MB, экзоцитоз SV происходит именно в областях MB, которые были случайно активированы. На основе этих результатов предлагается, чтобы совпадающие входные данные указывали место, где выделяется DA, тогда как DA вызывает пластические изменения, необходимые для кодирования ассоциаций. Однако было неясно, как активированные клетки Kenyon посылают ретроградный сигнал «потребности» пресинаптическим DA терминалам, чтобы индуцировать высвобождение SV (Ueno, 2020).

В этом исследовании использовалась рассеченная система мозга дрозофилы для изучения синаптической пластичности и высвобождения DA, и было обнаружено, что случайно активированные постсинаптические клетки Кеньона генерируют ретроградного мессенджера, монооксида углерода (CO). CO генерируется гемоксигеназой (HO) в постсинаптических нейронах MB и вызывает высвобождение DA из пресинаптических окончаний, вызывая высвобождение Ca2 + из внутренних запасов через рианодиновые рецепторы (RyRs). Таким образом, в то время как отдельные DA нейроны интенсивно иннервируют MB, экзоцитоз SV по требованию позволяет DA нейронам индуцировать пластичность в конкретных нейронах-мишенях (Ueno, 2020).

CO функционирует как ретроградный мессенджер по требованию для экзоцитоза SV в пресинаптических DA терминалах Центральный постулат нейробиологии состоит в том, что потенциалы действия, распространяющиеся из тел клеток, вызывают приток Са2 + в пресинаптические терминалы, вызывая экзоцитоз SV. Однако недавние исследования на млекопитающих показали, что только некоторая часть большого количества пресинаптических сайтов высвобождения DA участвует в каноническом экзоцитозе SV. В этом исследовании был идентифицирован новый механизм экзоцитоза SV, при котором активность постсинаптических нейронов вызывает пресинаптическое высвобождение, чтобы вызвать пластические изменения.Этот механизм позволяет строго определять время и место высвобождения DA по активности постсинаптических нейронов (Ueno, 2020).

Экзоцитоз SV по требованию использует CO в качестве ретроградного сигнала от постсинаптических нейронов MB к ​​пресинаптическим DA терминалам. CO удовлетворяет критериям, которые были предложены для ретроградного мессенджера: (1) было продемонстрировано, что HO, который катализирует продукцию CO, высоко экспрессируется в постсинаптических нейронах MB, что указывает на то, что нейроны MB обладают способностью синтезировать мессенджер; (2) было показано, что фармакологическое и генетическое подавление активности HO в МБ подавляет продукцию CO, пресинаптическое высвобождение DA и LTE, и (3) с использованием флуоресцентного зонда CO, COP-1, было продемонстрировано, что CO генерируется в MB после совпадающей стимуляции MB, и генерация CO ограничена долями нейронов MB, которые получают совпадающую стимуляцию.Кроме того, было показано, что прямое применение CO или донора CO вызывает высвобождение DA из пресинаптических окончаний, тогда как добавление акцептора CO, HemoCD, подавляет высвобождение. В-четвертых, было продемонстрировано, что CO активирует RyR в пресинаптических окончаниях, чтобы вызвать экзоцитоз SV. Поразительно, что CO-зависимый экзоцитоз SV не зависит от притока внеклеточного Ca2 +, а вместо этого требует оттока Ca2 + из внутренних запасов через RyR. Наконец, было показано, что фармакологическое ингибирование и генетическое подавление RyR в нейронах DA ухудшают высвобождение DA после одновременной стимуляции и применения CO (Ueno, 2020).

Другие ретроградные сигналы, такие как NO и эндоканнабиноиды, усиливают или подавляют канонический экзоцитоз SV, но это исследование обнаруживает, что CO-зависимое высвобождение DA происходит даже в условиях, которые блокируют активность нейронов и приток Ca2 + в пресинаптические DA-окончания. Это говорит о том, что CO не может модулировать канонический экзоцитоз SV, а вместо этого может вызывать экзоцитоз с помощью нового механизма. Несколько предыдущих исследований показали, что CO и RyR-зависимое высвобождение DA также происходит у млекопитающих.Исследование микродиализа показало, что CO увеличивает внеклеточную концентрацию DA в полосатом теле и гиппокампе крыс либо за счет увеличения высвобождения DA, либо за счет ингибирования обратного захвата DA. Также сообщалось, что фармакологическая стимуляция RyR вызывает высвобождение DA в полосатом теле мышей. Это высвобождение ослаблено у мышей с дефицитом RyR3, в то время как KCl-индуцированное высвобождение DA, которое требует притока внеклеточного Ca2 +, не затрагивается, что позволяет предположить, что RyR-зависимое высвобождение отличается от канонического высвобождения DA.Однако неизвестно, генерируется ли CO эндогенно и каким образом. Физиологические условия, которые активируют RyR, чтобы вызвать высвобождение DA, также неясны (Ueno, 2020).

В то время как большинство нейротрансмиттеров хранятся в синаптических везикулах и высвобождаются при деполяризации нейронов, высвобождение газообразных ретроградных мессенджеров, таких как NO и CO, вероятно, связано с активацией их биосинтетических ферментов, NOS и HO. У млекопитающих изоформа HO, HO-2, избирательно обогащается нейронами, а CO, производный от HO-2, как сообщается, обладает пластичностью.HO-2 активируется связыванием Ca2 + / кальмодулина (CaM) и фосфорилированием казеинкиназы II (CKII). Ранее было показано, что совпадающая стимуляция AL 1 NMDA вызывает устойчивое увеличение Ca 2+ в МБ, которое больше, чем увеличение от любой стимуляции по отдельности (Ueno, 2017). Предполагается, что это увеличение может активировать HO Drosophila в MB для генерации CO во время ассоциативной стимуляции. В то время как у Drosophila есть одна изоформа RyR, у млекопитающих есть три изоформы RyR1-RyR3. Скелетные и сердечные мышцы в основном экспрессируют RyR1 и RyR2, а мозг, включая полосатое тело, гиппокамп и кору, экспрессирует все три изоформы.Известно, что RyR активируются Ca2 +, чтобы опосредовать вызванное Ca2 + высвобождение Ca2 +. Однако вызванное CO высвобождение DA происходит даже в присутствии внеклеточных растворов, не содержащих Ca2 +, содержащих TTX и EGTA, что позволяет предположить, что CO активирует RyR по другому механизму. Помимо Ca2 +, RyR может активироваться кальмодулином, АТФ, PKA, PKG, cADP-рибозой и NO. NO может напрямую стимулировать RyR1 неферментативно путем S-нитрозилирования остатка гистидина, чтобы вызвать отток Ca2 +. Сообщалось, что CO активирует Ca2 + -активированные калиевые каналы (KCa) посредством неферментативной реакции в гладких мышцах артерий крыс, что повышает вероятность того, что он может активировать RyR посредством аналогичного механизма.Альтернативно, как NO, так и CO могут связываться с гемовой составляющей растворимой гуанлилатциклазы, что приводит к ее активации. Активированная растворимая гуанлилатциклаза продуцирует цГМФ, а цГМФ-зависимая протеинкиназа (PKG) быстро фосфорилирует и активирует RyR. Интересно, что NO увеличивает DA в полосатом теле млекопитающих независимо от нервной активности. Поскольку активация RyRs также увеличивает внеклеточный DA в полосатом теле, гиппокампе и коре головного мозга, NO может играть ключевую роль в активации RyRs и высвобождении DA у млекопитающих.Однако экспрессия NOS не была обнаружена в MBs, что указывает на то, что у Drosophila в этом процессе может функционировать CO, а не NO (Ueno, 2020).

Предыдущие исследования показали, что электрическая активность AL и AFV передается в MB холинергическими и глутаматергическими нейронами, действующими на nAChR и NMDAR соответственно. Хотя известно, что холинергические входы от AL доставляются проекционными нейронами, входы глутамата все еще неясны. Предыдущая работа идентифицировала глутаматергические нейроны, которые иннервируют a3 / a93-компартменты МБ и демонстрируют высвобождение SV при электрической стимуляции AFV (Ueno, 2017).Предполагается, что эти нейроны могут передавать информацию о стимулах AFV в MB. Альтернативно, в то время как NMDAR локализованы по всей доле MB, везикулярные переносчики глутамата терминалы обнаруживаются только редко на MB. Это говорит о том, что нейроны, экспрессирующие не охарактеризованный в настоящее время везикулярный транспортер глутамата, могут передавать информацию от AFV к MB (Ueno, 2020).

DA играет важную роль в ассоциативном обучении и синаптической пластичности. У мух нейтральные запахи вызывают реакции МБ, активируя редкие подмножества нейронов МБ.После сочетания с поражением электрическим током во время аверсивного обонятельного кондиционирования запахи вызывают более выраженную реакцию МБ в определенных областях МБ. Это пластическое изменение было смоделировано в мозге ex vivo как LTE, и было показано, что одного применения DA достаточно, чтобы вызвать этот больший ответ (Ueno, 2017). Однако в мозге дрозофилы только небольшое количество DA нейронов (~ 12 для аверсивных и ~ 100 для аппетитных) регулируют пластичность в ~ 2000 МБ клеток Kenyon. Таким образом, для образования ассоциаций, специфичных для запаха, должен существовать механизм, регулирующий выброс в отдельных синапсах.Зависимый от CO выпуск DA по запросу обеспечивает этот тип управления. Если высвобождение по требованию связано с пластичностью и ассоциативным обучением, нокдаун генов, связанных с высвобождением, должен повлиять на обучение. Действительно, это исследование показывает, что подавление либо dHO в MBs, либо RyR в нейронах DA нарушает обонятельное кондиционирование. Хотя эти нокдауны не полностью уничтожили обонятельное кондиционирование, это может быть связано с неэффективностью линий нокдауна. С другой стороны, высвобождение по требованию может быть не единственным механизмом, ответственным за формирование памяти, но вместо этого может потребоваться для определенной фазы обонятельной памяти (Ueno, 2020).

В исследованиях ex vivo это исследование показало, что высвобождение DA требует одновременной активации постсинаптических нейронов MB холинергическими и глутаматергическими стимулами. Однако другие исследования изображений in vivo показали, что нейроны DA могут активироваться и высвобождать DA только при стимуляции запаха или шоковом воздействии. Примечательно, что проекция окончаний DA разделена на доли MB и демонстрирует отчетливые ответы и высвобождение DA во время сенсорной обработки. В этих исследованиях были изучены дофаминергические нейроны, иннервирующие компартменты a3 / a93 на концах вертикальных долей MB, тогда как другие исследования были сосредоточены на компартментах, расположенных на горизонтальных долях MB.Это указывает на то, что пластичность в разных компартментах MB может регулироваться разными механизмами. К сожалению, из-за расположения микроэлектрода для стимуляции AL, которое вызывало помехи в флуоресцентной визуализации горизонтальных лепестков, в этом исследовании невозможно было получить надежные данные изображения этих лепестков. Еще одно различие между исследованиями ex vivo и in vivo заключается в том, что в исследованиях визуализации in vivo используются живые привязанные, рассеченные мухи, которые, вероятно, находятся в разных состояниях возбуждения / дистресса, подвергаются воздействию множества различных стимулов и могут образовывать непреднамеренные ассоциации.Напротив, мозг в препаратах ex vivo находится в более контролируемой среде и, вероятно, подвергается меньшему количеству непреднамеренных сенсорных стимулов. Это также может объяснить очевидные расхождения между ex vivo и предыдущими результатами in vivo (Ueno, 2020).

У млекопитающих роль CO в синаптической пластичности неясна. Применение CO в сочетании с низкочастотной стимуляцией индуцирует LTP, в то время как ингибирование HO блокирует LTP в области CA1 гиппокампа. Однако сообщалось, что у мышей с дефицитом HO-2 был нормальный CA1 LTP гиппокампа.В отличие от CO, ранее сообщалось о роли NO в синаптической пластичности и обучении. Таким образом, на данный момент остается открытым вопрос, вызывает ли CO или NO высвобождение DA у млекопитающих. Ниже по течению от CO или NO, RyRs, как было показано, необходимы для синаптической пластичности гиппокампа и мозжечка (Ueno, 2020).

Текущие результаты предполагают, что нейроны DA высвобождают DA посредством двух различных механизмов: канонического экзоцитоза и высвобождения по требованию. Канонический экзоцитоз вызывается электрической активностью пресинаптических DA нейронов, требует притока Ca2 + и может участвовать в передаче объема.Этот способ высвобождения со временем может активировать широко распространенные цели и подходит для регулирования глобальных функций мозга. Напротив, высвобождение по требованию вызывается активностью постсинаптических нейронов, требует оттока Ca2 + через RyR и может регулировать функцию конкретных мишеней в определенное время. DA нейроны могут по-разному использовать эти два режима экзоцитоза SV контекстно-зависимым образом. Понимание того, как DA-нейроны по-разному используют эти способы передачи, даст новое понимание того, как относительно небольшое количество DA-нейронов может контролировать множество различных функций мозга (Ueno, 2020).

Фагоцитоз важен во время развития и в иммунном ответе для удаления апоптотических клеток и патогенов, однако его молекулярные механизмы плохо изучены. В C. elegans путь CED2 / 5/10/12 регулирует актин во время фагоцитоза апоптотических клеток, тогда как роль пути CED1 / 6/7 в фагоцитозе неясна.В этом исследовании сообщается, что Гробовщик (UTA), белок юнктофилина дрозофилы, необходим для фагоцитоза, опосредованного Дрейпером (гомолог CED-1). Юнктофилины соединяют каналы Ca ²⁺ на плазматической мембране с каналами эндоплазматического ретикулума (ER), рецепторами рианодина. Это исследование помещает Draper, его адаптер drCed-6, UTA, рецептор рианодина Rya-r44F, датчик dSTIM ER Ca ²⁺ (молекула взаимодействия стромы) и Ca ²⁺ -активируемый высвобождением Ca ^2+. канал dOrai (olf186-F) в том же пути, который способствует гомеостазу кальция и фагоцитозу.Таким образом, эти результаты указывают на участие Junctophilin в фагоцитозе и связывают опосредованный Draper фагоцитоз с гомеостазом Ca ²⁺ , подчеркивая ранее не охарактеризованную роль пути CED1 / 6/7 (Cuttell, 2008).

Фагоцитоз — важнейший процесс развития и врожденного иммунитета всех многоклеточных организмов. Это позволяет быстро поглощать умирающие клетки и патогены специализированными фагоцитами, такими как макрофаги и нейтрофилы у млекопитающих. Фагоцитоз также является важной функцией дендритных клеток, которые представляют процессированные антигены лимфоцитам, тем самым связывая врожденный и адаптивный иммунитет.В C. elegans гены смерти ced-2 , 5 , 10 и 12 активируют малую GTPase CED-10, которая запускает перестройку актинового цитоскелета во время фагоцитоза; параллельный путь CED1 / 6/7 также сходится с CED-10, но его точная роль в фагоцитозе остается неуловимой (Mangahas, 2005; Cuttell, 2008 и ссылки там).

Во время эмбриогенеза дрозофилы два рецептора макрофагов, Croquemort (CRQ), гомолог CD36, и Draper (DRPR), гомолог CED-1 (Manaka, 2004), играют роль в клиренсе апоптотических клеток, как и их аналоги у млекопитающих. или С.elegans . Гомолог CED-6, Dmel / Ced-6 (далее называемый drCed-6) и DRPR у дрозофилы также необходимы в глиальных клетках для отсечения аксонов и поглощения дегенерирующих нейронов (Awasaki, 2006; MacDonald, 2006; Cuttell, 2008 и ссылки там).

При скрининге дефицита был охарактеризован мутант, в котором эмбриональные макрофаги плохо поглощали апоптотические клетки. При скрининге РНКи с использованием клеток S2 было выявлено, что гробовщик / ретинофилин ( uta ) отвечает за этот фенотип. uta кодирует белок, содержащий повторение мембранной профессиональной и узнавающей связи (MORN), гомологичный юнктофилинам млекопитающих (JP). JPs образуют соединительные комплексы между плазматической мембраной (PM) и эндоплазматическим / саркоплазматическим ретикулумом (ER / SR) Ca ²⁺ отсеком хранения (Takeshima, 2000). Эти комплексы допускают перекрестные помехи между каналами Ca ²⁺ в PM и ER / SR каналами Ca ²⁺ или рианодиновыми рецепторами (RyR), таким образом регулируя гомеостаз Ca ²⁺ и функции возбудимых клеток (Takeshima, 2000).Хотя роль Ca ²⁺ в фагоцитозе различных частиц фагоцитами млекопитающих была описана ранее, молекулярные механизмы, лежащие в основе потоков Ca ²⁺ , связанных с этими событиями, неизвестны (Cuttell, 2008).

Это исследование сообщает, что, что касается UTA, рецептор рианодина дрозофилы, Rya-r44F (Xu, 2000), играет роль в фагоцитозе апоптотических клеток in vivo. Потребность в фагоцитозе была обнаружена для запоминающего входа Ca ²⁺ (SOCE) через dSTIM, датчик Ca ²⁺ просвета ER / SR (Roos, 2005) и CRACM1 / dOrai, Ca ^{2 +} -активируемый высвобождением канал Ca ²⁺ (CRAC) (Feske, 2006; Vig, 2006). uta и rya-r44F генетически взаимодействуют с drced-6 и drpr , а uta , drced6 и drpr необходимы для SOCE в клетках S2. Таким образом, эти гены действуют по тому же пути, который играет общую роль в фагоцитозе, так как uta , dstim , dorai , drced-6 и drpr также необходимы для эффективного фагоцитоза бактерий. Эти результаты обеспечивают связь между SOCE и фагоцитозом, подразумевают, что UTA играет такую ​​же роль в макрофагах, что и JP в возбудимых клетках, и проливают свет на роль пути CED1 / 6/7 в гомеостазе Ca ²⁺ во время фагоцитоза. (Каттелл, 2008).

Связывание различных частиц вызывает повышение [Ca ²⁺ ] i в фагоцитах млекопитающих. В дендритных клетках [Ca ²⁺ ] i увеличивается при связывании апоптотических клеток через интегрин, и исследования ингибирования показали, что как высвобождение Ca ²⁺ из пула хранения ER / SR, так и проникновение внеклеточного Ca ²⁺ в цитозоль необходимы для этого процесса. Нейтрофилы также полагаются на такие изменения, чтобы способствовать поглощению частиц. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе этого повышения [Ca ²⁺ ] i, и то, какую роль он играет в фагоцитах, плохо изучены (Cuttell, 2008).

Это исследование показало, что uta , ген дрозофилы, кодирующий родственный JP белок, необходим для фагоцитоза апоптотических клеток. Приведены генетические данные о роли рецептора рианодина, Rya-r44F, и uta и rya-44F были генетически связаны. SOCE через dstim и dorai способствует эффективному очищению клеток от апоптоза. uta и rya-44F были генетически связаны с drpr и drced-6 , и роль была обнаружена для uta , drpr и drced-6 в SOCE, тем самым демонстрируя функциональную связь между путем DRPR / drCed-6 и SOCE во время фагоцитоза (Cuttell, 2008).

Предложена модель, согласно которой связывание апоптических клеток через DRPR (и, возможно, другие рецепторы, такие как CRQ) приводит к высвобождению ER Ca ²⁺ через Rya-r44F. DRPR, который несет иммунорецепторный тирозиновый мотив активации (ITAM), который фосфорилируется посредством передачи сигналов, опосредованной киназами семейства Src и Syk, по-видимому, ведет себя как иммунорецептор (Ziegenfuss, 2008). В В- и Т-лимфоцитах вовлечение иммунорецепторов Fc (передача сигналов которых также зависит от фосфорилирования ITAM) приводит к повышению [Ca ²⁺ ] i.Т.о., DRPR может играть роль, сходную с ролью рецепторов Fc в передаче сигналов, приводя к повышению [Ca ²⁺ ] i в макрофагах (Cuttell, 2008).

UTA локализуется в ER и PM. Таким образом, предполагается, что подобно JPs, UTA формирует соединительные комплексы, которые связывают события PM с ER и запускают высвобождение Ca ²⁺ из хранилищ ER. Текущие исследования, однако, не касались того, требуется ли образование соединительных комплексов UTA для запуска высвобождения ER Ca ²⁺ через Rya-r44F, а также то, что запускает высвобождение ER Ca ²⁺ .Мембранный потенциал покоя фагоцитов млекопитающих деполяризуется при контакте с апоптотическими клетками. Как и в мышечных клетках млекопитающих, такие изменения в фагоцитах мух могут инициировать высвобождение ER Ca ²⁺ (Cuttell, 2008).

В клетках S2 Ca ²⁺ результаты визуализации с drpr и drced-6 РНКи и другие с drced-6 RNAi (Vig, 2006) предполагают, что drpr и drced-6 необходимы для опосредованного dOrai входа Ca ²⁺ после обработки TG (что позволяет избежать связывания частиц с рецептором).Предполагается, что высвобождение ER Ca ²⁺ передается обратно на DRPR и drCed-6, чтобы активировать их нижестоящий сигнальный каскад. Хотя для проверки обоснованности этого предложения потребуются дальнейшие исследования, несколько отчетов уже подтверждают это: DRPR-опосредованный фагоцитоз зависит от передачи сигналов киназ семейства Src и Syk (Ziegenfuss, 2008), и активность таких киназ может быть Ca ^2+. зависит в клетках млекопитающих (Cuttell, 2008).

Затем предполагается, что передача сигналов ниже DRPR и drCed-6 способствует и / или поддерживает образование соединительных комплексов UTA, тем самым связывая высвобождение ER Ca ²⁺ с SOCE.dSTIM действительно может действовать как сенсор ER Ca ²⁺ , который олигомеризуется (Luik, 2008) и перераспределяется в соединения ER-PM после истощения ER Ca ²⁺ , как и его аналоги у млекопитающих (Feske, 2007). Предполагается, что соединительные комплексы UTA необходимы для поддержания непосредственной близости между хранилищами ER Ca ²⁺ и PM и для сопоставления олигомеров dSTIM и dOrai, тем самым способствуя конформационным изменениям и открытию dOrai. DRPR- и drCed-6-зависимая передача сигналов и / или UTA также могут быть необходимы для олигомеризации dSTIM.Результирующее увеличение [Ca ²⁺ ] i затем способствует поглощению частицы (Cuttell, 2008).

Ca ²⁺ может способствовать фагоцитозу несколькими путями. Он может усиливать активность рецепторов-скавенджеров (SR): адгезия макрофагов мыши к покрытой фибронектином поверхности посредством связывания интегрина приводит к увеличению количества SR в их PM, что увеличивает их связывающую активность. Это обогащение SR зависит от внеклеточного притока Ca ²⁺ , что свидетельствует в пользу роли Ca ²⁺ в перемещении и / или рециркуляции SR.Некоторые SR или родственные рецепторы играют роль в фагоцитозе апоптотических трупов, включая CD36 млекопитающих и его гомолог CRQ дрозофилы. Хотя изменений в экспрессии CRQ в макрофагах uta не наблюдалось, CRQ и UTA совместно локализуются и генетически взаимодействуют. Одна из возможных моделей состоит в том, что CRQ рекрутируется в фагоцитарную чашку после связывания апоптотических клеток после SOCE, которое зависит от UTA, DRPR и drCed-6, и что это может усиливать связывание и поглощение трупом (Cuttell, 2008).

В C. elegans , CED-1 (гомолог DRPR) связан с рецептором эндотелиального скавенджера SREC. Его рекрутирование в фагоцитарную чашку зависит от функционального CED-7 и может происходить путем экзоцитоза. Компоненты экзоцисты участвовали в фагоцитозе. Более того, Orai1 необходим для дегрануляции тучных клеток, которая происходит путем экзоцитоза. Таким образом, как и Orai1, dOrai может потребоваться для экзоцитоза, и, в то время как DRPR, по-видимому, всегда присутствует в PM, CRQ может рекрутироваться из его внутриклеточного везикулярного пула в фагоцитарную чашку посредством экзоцитоза, как ранее предлагалось для CED-1, для стимулирования поглощение апоптотическими клетками (Cuttell, 2008).

Повышение Ca ²⁺ наблюдалось в нейтрофилах млекопитающих после связывания частиц, и Ca ²⁺ участвует в фагоцитозе, способствуя распаду F-актина и созреванию фагосом. Mycobacterium tuberculosis способна проникать в макрофаги человека, не вызывая увеличения [Ca ²⁺ ] i: в отсутствие передачи сигналов Ca ²⁺ фагосомы, содержащие M. tuberculosis , не созревают, что, возможно, объясняет выживаемость этой бактерии в клетке.Роль Ca ²⁺ в связывании частиц и созревании фагосом в макрофагах, однако, когда-то не принималась во внимание. Для запуска SOCE требуются uta , dstim , dorai , drCed-6 и drpr . Тем не менее, хотя они плохо фагоцитируют, макрофаги в drced-6, гипоморфах и drpr нуль-мутантах поглощают бактерии в полностью созревшие фагосомы, что является аргументом против участия Ca ²⁺ в созревании фагосом.Это созревание, однако, может все еще происходить с меньшей эффективностью, когда SOCE терпит неудачу, поскольку обработанные RNAi S2 клетки для всех генов этого пути плохо поглощают бактерии (Cuttell, 2008).

Открытие того, что UTA связывает DRPR-опосредованный фагоцитоз и гомеостаз Ca ²⁺ , дает возможность продолжить рассечение пути DRPR у Drosophila. DRPR гомологичен CED-1, который принадлежит к пути CED1 / 6/7, где CED-7 является переносчиком ABC. Интересно, что переносчик ABC может модулировать активность канала Ca ²⁺ в растениях, дополнительно поддерживая связь между CED1 / 6/7-подобными путями и гомеостазом Ca ²⁺ , который, по-видимому, сохранялся на протяжении всей эволюции.Более того, мутация Orai1 человека была обнаружена у некоторых пациентов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Feske, 2006). Таким образом, проведение таких исследований может иметь отношение к системам млекопитающих и здоровью человека (Cuttell, 2008).

Активность вызывает захват везикул с плотным ядром (DCV), которые проходят через покоящиеся синаптические бутоны дрозофилы, чтобы произвести отскок содержания пресинаптических нейропептидов после высвобождения.Начало захвата перекрывается с увеличением подвижности DCV, уже присутствующих в синаптических бутонах. Мобилизация везикул требует вызванного Ca ²⁺ высвобождения Ca ²⁺ пресинаптическим эндоплазматическим ретикулумом (ER) рианодиновыми рецепторами (RyR), которые, в свою очередь, стимулируют Ca ²⁺ / кальмодулин-зависимую киназу II (CamKII). Это исследование показывает, что такая же передача сигналов необходима для зависимого от активности захвата транзитных DCV. В частности, ингибитор CamKII KN-93, но не его неактивный аналог KN-92, устраняет обратную замену нейропептидергических DCV в синаптических бутонах.Кроме того, фармакологическое или генетическое ингибирование кальциевой АТФазы (SERCA) нейронального сарко-эндоплазматического ретикулума с целью истощения пресинаптических запасов ER Ca ²⁺ или прямое ингибирование RyR предотвращало реакцию захвата. Эти результаты показывают, что пресинаптический путь RyR-CamKII, который запускает мобилизацию резидентных синаптических DCV для облегчения экзоцитоза, также обеспечивает зависимый от активности захват транзитных DCV для пополнения запасов нейропептидов (Wong, 2009).

Функция нервных окончаний зависит от везикулярной доставки белков, синтезируемых в соме, к синаптическим бутонам.Известно, что транспортные везикулы содержат каналы, компоненты активной зоны и нейропептиды. В отличие от белков синаптических мембран и классических трансмиттеров, которые повторно используются после экзоцитоза, высвобождение нейропептидов необратимо. Таким образом, пептидергическая передача зависит от замещения содержащих нейропептиды плотных сердцевинных везикул (DCV). Это потенциально очень медленный процесс, потому что доставка везикул, синтезированных в соме, к нервным окончаниям с помощью быстрого аксонального транспорта может занять несколько дней.Однако была обнаружена клеточная биологическая стратегия, позволяющая обойти такие задержки. Зависимый от активности захват транзитных пузырьков использует пул DCVs, которые быстро проходят через покоящиеся нервные окончания, но захватываются в ответ на всплеск активности (Shakiryanova, 2006). Начало этого захвата, которое проявляется в уменьшении оттока DCV и повышенном содержании нейропептидов в синаптических бутонах, происходит в течение нескольких минут, а не часов, которые потребовались бы для обычного устойчивого замещения DCV.По сути, нервное окончание может подключаться к транзитному пулу DCV для быстрого пополнения запасов нейропептидов без какого-либо прямого участия сомы. Следовательно, зависящий от активности захват транзитных DCV устраняет задержку доставки возникающих DCV, распределяет ресурсы в зависимости от активности и помещает контроль за хранением синаптических нейропептидов в местах высвобождения, а не в месте синтеза (например, в соме) (Шакирьянова, 2006) . Сходный процесс рекрутирования также происходит с нейротрипсин-содержащими пузырьками, которые, как было установлено, быстро подвергаются экзоцитозу после стимулированного захвата (Frischknecht, 2008).Сходным образом захват пузырьков, по-видимому, участвует в высвобождении пресинаптического белка Wnt / Wingless (Ataman, 2008). Следовательно, зависимый от активности захват транзитных везикул поддерживает высвобождение синаптических нейропептидов, ферментов и онтогенетических пептидов (Wong, 2009).

Сигнализация, необходимая для зависящего от активности захвата транзитных DCV, неизвестна. Большая продолжительность этого ответа в двигательных нейронах дрозофилы (т.е. ~ 0,5 часа) в сочетании с потребностью в электрической активности предполагает потенциальное участие фосфорилирования, индуцированного Ca ²⁺ .Фактически, недавние эксперименты показали, что такая передача сигналов увеличивает подвижность резидентных DCV в синаптических бутонах. Мобилизация, которая запускается притоком Ca ²⁺ и сохраняется в течение ~ 10 минут (Шакирьянова, 2005), требует вызванного Ca ²⁺ высвобождения Ca ²⁺ из пресинаптического эндоплазматического ретикулума через рианодиновые рецепторы (RyRs ) (Шакирьянова, 2007). Впоследствии Ca ²⁺ / кальмодулин-зависимая протеинкиназа II (CamKII) активируется как необходимый шаг для мобилизации DCV (Шакирьянова, 2007).Перекрывающееся начало реакций захвата и мобилизации в первые минуты после кратковременного столбняка стимулировало исследование того, участвует ли путь RyR-CamKII в зависимом от активности захвате транзитных пузырьков (Wong, 2009).

В этом исследовании нейропептид, помеченный GFP (зеленый флуоресцентный белок), был визуализирован в интактном нервно-мышечном соединении дрозофилы. Отскок в синаптических хранилищах нейропептидов после вызванного активностью высвобождения, который вызывается захватом транзитных пузырьков (Shakiryanova, 2006), требует RyR-опосредованного оттока Ca ²⁺ из пресинаптического ER и активации CamKII.Следовательно, передача сигналов RyR-CamKII инициирует как мобилизацию резидентных DCVs внутри синаптических бутонов, так и захват DCVs из быстро перемещающегося пула (Wong, 2009).

Визуализация in vivo показала, что короткий период активности вызывает длительную мобилизацию и захват DCV. Эти процессы независимы, потому что захват требует аксонального транспорта, а мобилизация — нет (Shakiryanova, 2005; Shakiryanova, 2006). Тем не менее, начало мобилизации резидентных DCV и захват транзитных DCV перекрываются (т.е., оба развиваются в течение нескольких минут после секунд активности). Это наблюдение стимулировало проверку гипотезы о том, что эти два механизма запускаются одним и тем же сигналом. Предыдущие исследования установили, что приток Ca ²⁺ запускает мобилизацию DCV за счет активации RyR-опосредованного высвобождения Ca ²⁺ из пресинаптического ER, что, в свою очередь, стимулирует CamKII (Shakiryanova, 2007). Фармакологические и генетические эксперименты, представленные в этом исследовании, устанавливают, что передача сигналов RyR-CamKII также необходима для зависимого от активности захвата транзитных DCVs (Wong, 2009).

Это открытие поднимает вопрос о том, как один сигнальный путь вызывает ответы с разной продолжительностью: после нескольких секунд активности мобилизация DCV длится ~ 10 минут, в то время как реакция захвата длится ~ 40 минут (Шакирьянова, 2005; Шакирьянова, 2006). Одно из возможных соображений состоит в том, что эти кинетические различия могут возникать в процессах, ответственных за обращение мобилизации и захвата. В частности, передача сигналов RyR-CamKII может запускать эти два процесса параллельно, но дефосфорилирование отдельных субстратов CamKII может происходить с разными скоростями, возможно, из-за участия разных фосфатаз.Это возможное объяснение предполагает, что идентификация субстратов CamKII, которые обеспечивают мобилизацию и захват, будет важна для понимания разнообразия длительных ответов, инициируемых пресинаптической передачей сигналов RyR-CamKII, запускаемой активностью. Недавно было обнаружено, что CamKII-зависимое фосфорилирование белка суперсемейства кинезинов 17 (KIF17) является важным для разгрузки грузов, несущих рецепторы NMDA, из микротрубочек вблизи постсинаптической плотности (Guillaud, 2008). Следовательно, CamKII может индуцировать захват, запуская диссоциацию транзитных DCV из их молекулярного моторного динактинового комплекса, который будет содержать как член семейства кинезин-3 UNC-104 / Kif1, так и ретроградный мотор динеина, в то время как мобилизация может зависеть от другого субстрата CamKII.Альтернативно, некоторый процесс после дефосфорилирования может определять скорость обращения захвата. Напр., Как только захваченные пузырьки будут возвращаться в транзитный пул, им может потребоваться рекрутировать незанятый моторный комплекс для поддержки быстрого транзита. Если такие комплексы редки, то восстановление после захвата будет очень медленным. Напротив, восстановление после мобилизации, которое не требует выхода из бутона, не будет ограничиваться таким же образом. Независимо от конкретной основы для различных временных курсов мобилизации и захвата, использование одного и того же сигнального пути для индукции обоих этих эффектов является элегантным средством, гарантирующим, что облегчение высвобождения сочетается с заменой истощенных синаптических хранилищ нейропептидов (Wong, 2009 г.).

Ca ²⁺ может стимулировать синтез циклических нуклеотидов, но неизвестно, происходит ли эта передача сигналов в нервных окончаниях в ответ на активность. В этом исследовании in vivo визуализация окончаний мотонейронов дрозофилы показывает, что активность быстро индуцирует длительный сигнал от трансгенно экспрессируемого оптического индикатора, основанного на цАМФ-связывающем домене epac1 (обменный белок, непосредственно активируемый цАМФ 1).Реакция сенсора epac1-cAMP (лагеря) в синаптических бутонах зависит от внеклеточного Ca ²⁺ и индуцированного рианодиновым рецептором высвобождения Ca ²⁺ -индуцированного Ca ²⁺ из эндоплазматического ретикулума. Однако мутации, которые ингибируют брюкву Ca ²⁺ -стимулированную аденилатциклазу и dunce цАМФ-специфическую фосфодиэстеразу (PDE), не имеют никакого эффекта. Напротив, зависимый от активности пресинаптический сигнал epac1-camps отражает повышение цГМФ в ответ на гуанилилциклазу, активируемую оксидом азота.Посттетанический пресинаптический цГМФ является долгоживущим из-за ограниченной активности ФДЭ. Таким образом, биохимическая передача сигналов нервных окончаний, индуцированная короткими приступами активности, суммируется во временном масштабе на порядки величины дольше, чем быстрая передача (Шакирьянова, 2008).

Механизмы, контролирующие уровни циклических нуклеотидов в нервном окончании, неизвестны. Индуцированный активностью приток пресинаптического Ca ²⁺ может быть вовлечен, потому что некоторые циклазы непосредственно активируются Ca ²⁺ .Например, ген брюквы , который влияет на синаптическую пластичность и развитие у Drosophila, кодирует нейрональную аденилатциклазу, стимулированную Ca ²⁺ . Однако эта изоформа также стимулируется белком Gsα G. Таким образом, неясно, отражают ли пресинаптические эффекты аденилилциклазы брюквы пермиссивный фоновый эффект или активацию Gsα или Ca ²⁺ . Определение механизмов, ответственных за активацию пресинаптических циклаз, было трудным, потому что было невозможно напрямую измерить циклические нуклеотиды в живых нервных окончаниях (Shakiryanova, 2008).

Недавно был создан ратиометрический датчик цАМФ на основе FRET (лагеря), который использует цАМФ-связывающий домен epac (обменный белок, непосредственно активируемый цАМФ), чтобы сообщить об активации аденилилацилазы форсколином и рецепторами. Здесь, изображение in vivo показывает, что активность быстро индуцирует Ca ²⁺ -зависимый ответ epac1-camps в синаптических бутонах мотонейронов дрозофилы. Удивительно, но этот ответ является длительным и не подвержен влиянию мутантов, которые разрушают брюкву , которая снижает цАМФ нейронов, или dunce цАМФ-специфическую фосфодиэстеразу (PDE), которая повышает цАМФ нейронов.Представлены фармакологические и генетические эксперименты, которые идентифицируют пресинаптическую биохимическую сигнализацию, обнаруженную epac1-camps, и объясняют, как она суммируется во времени на временной шкале в минутах (Шакирьянова, 2008).

Пресинаптический ответ epac1-camps зависит от притока Ca ²⁺ и индуцированного Ca ²⁺ высвобождения Ca ²⁺ . Во-первых, удаление внеклеточного Ca ²⁺ отменило изменение FRET, вызванное столбняком. Во-вторых, рианодин (Ry) блокирует индуцированное Ca ²⁺ высвобождение Ca ²⁺ рецепторами Ry (RyR) эндоплазматического ретикулума (ER), что устраняет зависящую от активности мобилизацию везикул и захват транзитных везикул в нерве дрозофилы. терминалы, уменьшили реакцию epac1-camps.Чтобы проверить, что RyR ответственны за это частичное ингибирование, ER Ca ²⁺ был истощен тапсигаргином (Tg). В этих условиях Ry не оказывал эффекта, подтверждая, что RyR-опосредованное высвобождение Ca ²⁺ , вызванное Ca ²⁺ , было задействовано. Кроме того, эффекты Tg и Ry были статистически неразличимы, что означает, что RyR полностью объясняют участие ER Ca ²⁺ хранилищ (то есть не было доказательств индуцированного ауторецепторами инозитол-трифосфат-опосредованного высвобождения ER Ca ²⁺ ).Вместе эти результаты показывают, что вызванное Ca ²⁺ высвобождение Ca ²⁺ из ER усиливает передачу сигналов циклических нуклеотидов, индуцированную притоком Ca ²⁺ (Шакирьянова, 2008).

In vivo визуализация epac1-лагерей в нервных окончаниях дала ряд поразительных результатов. Во-первых, в синаптических бутонах был продемонстрирован зависимый от активности синтез циклических нуклеотидов. Это открытие устанавливает механизм связывания активности нервных окончаний с передачей сигналов cGMP, который индуцирует экзоцитоз синаптических пузырьков в бутонах мотонейронов дрозофилы и поддерживает пластичность в других синапсах.Во-вторых, предыдущие исследования NOS-cGMP в синапсах были сосредоточены на трансинаптических эффектах (например, NO как ретроградный сигнал). Однако, поскольку глутаматергическая передача ингибируется и постсинаптические мышцы в этом препарате не продуцируют цГМФ в ответ на NO, образование NO и активация гуанилилциклазы происходят пресинаптически. Такое расположение сводит к минимуму разведение NO, чтобы вызвать устойчивые ответы цГМФ, вызванные активностью, в окончаниях мотонейронов. В-третьих, цГМФ, синтезируемый в ответ на короткие приступы активности, является долгоживущим в синаптических бутонах, потому что активность PDE, отличная от dunce , ограничена в нервном окончании.Следовательно, временное суммирование ответов цГМФ происходит в масштабе времени на порядки дольше, чем нейротрансмиссия. Длительная передача сигналов, индуцированная электрической активностью, может быть важна для множества NOS-зависимых процессов в нервной системе насекомых (Shakiryanova, 2008).

У позвоночных и беспозвоночных сенсорные нейроны адаптируются к изменяющимся условиям окружающей среды, таким как продолжительность или повторение стимула, физиологический механизм, рассматриваемый как простая форма неассоциативного обучения и нейрональной пластичности.Хотя различные сигнальные пути, такие как цАМФ, цГМФ и инозитол-1,4,5-трифосфатный рецептор (InsP3R), играют роль в адаптации, их точные механизмы действия на клеточном уровне остаются не совсем понятными. У дрозофилы было показано, что индуцированный запахом Са2 + -ответ в терминалах аксонов обонятельных рецепторных нейронов (ORN) связан с продолжительностью запаха. В частности, относительно продолжительный запах запаха (например, 5 с) запускает индукцию второго компонента, включающего внутриклеточные запасы Ca2 +.Недавно разработанный подход к визуализации биолюминесценции in vivo был использован для количественной оценки вызываемой запахом Ca2 + -активности в аксонных окончаниях ORN. Используя либо генетический подход для нацеливания на специфические РНК, либо фармакологический подход, это исследование показало, что второй компонент, основанный на внутриклеточных запасах Ca2 +, отвечает за адаптацию к повторяющимся стимулам. В антеннальных долях (область, аналогичная обонятельной луковице позвоночных) ORN устанавливают синаптические контакты с нейронами второго порядка, проекционными нейронами (PN).Эти синапсы модулируются ГАМК через либо ГАМКергические локальные интернейроны (ЛУ), либо некоторые ГАМКергические ПН. Применение антагонистов ГАМКергических рецепторов, как ГАМК, так и ГАМКА, отменяет адаптацию, в то время как РНКи, нацеленная на ГАМКАР (метаботропный рецептор) в ORN, блокирует компонент, зависящий от запаса Ca2 +, и, следовательно, нарушает адаптацию. Эти результаты показывают, что ГАМК осуществляет контроль с обратной связью. Наконец, на поведенческом уровне, используя обонятельный тест, генетическое нарушение GABABR или его сигнального пути, особенно в ORN, нарушает обонятельно адаптированное поведение.Взятые вместе, эти результаты показывают, что относительно продолжительная форма адаптации происходит в терминалах аксонов ORN в антеннальных долях, которая зависит от внутриклеточных запасов Ca2 +, что связано с положительной обратной связью через ГАМКергические синапсы (Murmu, 2011).

Это исследование предоставляет доказательства того, что биолюминесцентный (GFP-экворин) Ca ²⁺ -сенсор достаточно чувствителен, чтобы контролировать Ca ²⁺ -ответ в соответствии с различными протоколами (продолжительность и частота повторения) применения запаха.1 секунда запаха вызывает реакцию, которая существенно не уменьшается при повторении каждые 5 минут, тогда как более длительный стимул, такой как 5 секунд, достаточен для того, чтобы вызвать уменьшение ответа после повторных стимуляций запахом (адаптация). Точно так же использование 5-секундной стимуляции запаха и увеличение частоты повторения до 1-минутных интервалов также вызывает более быструю адаптацию в зависимости от запаха. Также было продемонстрировано, что длительное воздействие запаха (до 2 минут) генерирует устойчивый Ca ²⁺ -ответ в терминалах аксона ORN, что указывает на то, что ORN способны реагировать, пока присутствует запах, даже дольше.Эта работа также указывает на то, что зонд GFP-акворин не является ограничивающим фактором для обнаружения активности Ca ²⁺ . Эти физиологические результаты (снижение активности Ca ²⁺ в соответствии с длительной / устойчивой продолжительностью запаха и / или повторением запаха) согласуются с предыдущими исследованиями, в которых сообщается, что адаптация зависит как от продолжительности стимула, так и от частоты его воздействия. повторение (Мурму, 2011).

Различные физиологические подходы, основанные либо на флуоресцентной визуализации мозга, либо на электрофизиологических методах, ранее сообщали об индуцированной запахом активности в различных взаимосвязанных нейронах в антеннальных долях различных модельных беспозвоночных организмов, включая медоносных пчел, с целью расшифровки нейронного кода запаха.Однако, за исключением одного исследования, проведенного на саранче, которое косвенно описывает форму адаптации, не сообщалось о длительных формах адаптации в ORN, таких как описанные в этом исследовании. Вероятно, это связано с экспериментальным дизайном этих предыдущих исследований, в которых либо обычно учитывался сигнал, вызванный запахом, только после того, как реакция стабилизировалась (обычно после примерно 5 последовательных применений запаха), либо использовалась более короткая продолжительность стимуляции запаха (<= 1 с), что, как продемонстрировано в этом исследовании, недостаточно, чтобы вызвать обнаруживаемую и надежную адаптацию.Кроме того, другие полагались на внеклеточные записи сенсилл антенн, которые отражают активность, происходящую в телах клеток ORN. В этом исследовании мониторинг окончания аксонов ORN, 5-секундная стимуляция запаха, повторяемая с 5-минутными интервалами, вызвала относительно длительную адаптацию, которая с точки зрения кинетики напоминает длительную адаптацию (LLA), описанную в ORN в саламандры. Действительно, что интересно, время восстановления (15 минут для мяты и октанола и 30 минут для цитронеллы) происходит в аналогичной временной шкале в ORN саламандр (которые отличаются от длительной обонятельной адаптации, описанной в C.elegans . Однако, в отличие от длительной адаптации, о которой сообщалось в изолированных ORN, адаптация, описанная в этом исследовании, по-видимому, полагается на другие механизмы, поскольку она чувствительна к « контролю обратной связи », обеспечиваемому ГАМКергической синаптической передачей в долях антенн ( Мурму, 2011).

У Drosophila мутанты, лишенные InsP ₃ R, дефектны в обонятельном адаптивном поведении. У позвоночных также сообщалось о различных формах обонятельной адаптации в ORN.Во-первых, это исследование показывает на Drosophila , что механизм адаптации происходит в терминале аксона ORNs в долях антенн. Во-вторых, с использованием двух независимых подходов, фармакологического и генетического, было показано, что специфическая адаптация, индуцированная запахом, в основном зависит от InsP ₃ R и RyR. Когда эти два разных рецептора заблокированы или сбиты с толку, хотя между разными состояниями можно наблюдать некоторую разницу (вариабельность), в целом ответ на Ca ²⁺ , вызванный запахом, больше не адаптируется или подвергается серьезному воздействию.Более конкретно, кажется, что отсутствие адаптации связано с неиндукцией «второго компонента с задержкой и медленным ростом» отклика Ca ²⁺ , который запускается в определенных и конкретных условиях: когда продолжительность стимуляция запаха относительно продолжительна (1 с не вызывает его, а 5 с вызывает важный второй компонент. В качестве альтернативы, второй компонент реакции также индуцируется и виден, особенно на первом и в меньшей степени, на втором запахе применения, особенно когда запах последовательно повторяется.Этот второй компонент постепенно исчезает при последовательном повторении. То есть адаптация не напрямую связана со снижением ответа, а скорее косвенно с дефектом пресинаптического повышения Ca ²⁺ из-за отсутствия запускающего высвобождения внутриклеточных запасов Ca ²⁺ , обычно происходящего в первом и последующих ответах на достаточно сильный (длительный стимул) или на повторяющиеся стимулы. Эти результаты предполагают, что один из основных внутриклеточных механизмов адаптации зависит от внутренних запасов Ca ²⁺ .Короче говоря, внутриклеточный механизм был заблокирован, что позволяет клетке адаптироваться к длительным или повторяющимся стимулам. Интересно, что у млекопитающих в пирамидных нейронах СА3 гиппокампа внутриклеточные запасы Ca ²⁺ , которые контролируются InsP ₃ R и / или RyR на пресинаптическом окончании, ранее участвовали в высвобождении нейротрансмиттеров, а также в синаптических процессах. пластичность (Мурму, 2011).

У позвоночных пластичность нейронов, связанная с представлением запаха, происходит в синапсе между ORN и нейронами второго порядка в клубочках обонятельных луковиц, области, аналогичной усиковым лепесткам беспозвоночных.В этом синапсе передача сигнала пресинаптически модулируется несколькими механизмами, главный из которых — через метаботропные рецепторы GABA _B . Это подавляет пресинаптический приток Ca ²⁺ и последующее высвобождение медиатора из конца рецепторных нейронов. По крайней мере, два вида пресинаптического торможения (внутри- и межклубочковое) опосредуются рецепторами GABA _B . Внутрикломерулярное пресинаптическое ингибирование, по-видимому, контролирует входную чувствительность, в то время как межклубочковое пресинаптическое ингибирование, по-видимому, увеличивает контраст сенсорного входного сигнала (хотя два исследования, посвященные этому вопросу in-vivo , показывают противоречивые результаты).У Drosophila , похоже, имеет место аналогичный механизм, поскольку межклубочковое пресинаптическое ингибирование, опосредованное как ионотропными, так и метаботропными рецепторами на одном и том же конце аксона ORN, опосредует механизм контроля усиления, служащий для регулирования усиления PN в ответ на стимуляцию ORN. (Olsen, 2008). Еще одно исследование показало, что рецепторы GABA _B , но не рецепторы GABA _A участвуют в пресинаптическом ингибировании (Root, 2008), что противоречит этому. В этом исследовании, отслеживая высвобождение Ca ²⁺ из терминалей аксонов ORN, в экспериментальных условиях, которые генерируют длительную форму адаптации, было показано, что ГАМКергическая синаптическая передача играет роль в адаптации.Оба ионотропных антагониста GABA _A R, бикукуллин и пикротоксин, частично или полностью блокируют Ca ²⁺ -ответ, в то время как CGP54626, метаботропный антагонист GABA _B R, также блокирует адаптацию, хотя и не полностью. Следует отметить, что нанесение пикротоксина per se индуцирует сильное временное высвобождение Ca ²⁺ в терминалах аксонов ORN даже без воздействия запаха. Этот «эффект кратковременного высвобождения», вероятно, нарушает состояние покоя нейронов, что, вероятно, объясняет наблюдаемое значительное снижение амплитуды реакции, вызванной запахом.Тем не менее, эти результаты предполагают, что оба типа рецепторов ГАМК (А и В) участвуют в адаптации. Более того, как было предложено в исследовании Olsen and Wilson (2008), нельзя исключать, что ORN также экспрессируют различные подтипы GABA _A R (гомо- и / или гетеромультимеры), поскольку результаты показали, что пикротоксин и особенно бикукуллин, два различных ингибитора ГАМК _A R, блокируют адаптацию. Другая возможность состоит в том, что эффект двух антагонистов GABA _A R является результатом блокирования GABA _A R на других нейронах в долях антенн, таких как LN или определенные PN (которые еще не были продемонстрированы).И, наконец, к сожалению, этот фармакологический подход не позволяет различить, какими именно нейронами опосредуется эта ГАМК-зависимая адаптация. С целью выяснить, в каких именно нейронах действует ГАМКергическая передача, метаботропная ГАМК _B R (ГАМК _B R2-RNAi) или ее сигнальный путь (UAS-PTX) были заблокированы непосредственно в ORN. Это приводит к дефектам длительной адаптации к нескольким условиям, по-видимому, в зависимости от запаха. Таким образом, хотя ГАМКергические эффекты были описаны в ORN как Drosophila , так и млекопитающих, чтобы поддержать «подавление обратной связи», в этом исследовании сообщается, что в различных экспериментальных условиях, таких как длительная продолжительность запаха (5 с) и / или повторение стимула , он также участвует в процессе адаптации.Действительно, результаты показывают, что передача сигналов ГАМК поддерживает контроль положительной (возбуждающей) обратной связи вместо тормозящей обратной связи, как ранее сообщалось в других исследованиях. Хотя эти результаты кажутся противоречивыми, можно дать некоторые объяснения. Во-первых, как упоминалось выше, экспериментальные условия разные: в этом исследовании использовалась относительно высокая концентрация запаха с относительно большой продолжительностью запаха (5 с). Кроме того, записи были сделаны сразу после первого и последующего применения запаха, в то время как в экспериментальном протоколе некоторых исследований запах обычно предъявляется несколько раз (грунтовка) перед началом записи.Следовательно, похоже, что эти предыдущие исследования были выполнены на уже адаптированных ORN. Это означает, что нейронная сеть в долях антенн уже была стимулирована, и, следовательно, ее динамика, вероятно, уже была изменена, поскольку, как описано в этом исследовании, важный эффект возникает сразу после первого нанесения запаха. Более того, GFP-экворин позволяет непрерывно в течение длительного периода времени контролировать внутриклеточный уровень кальция с высокой чувствительностью к [Ca ²⁺ ] (от ~ 10 ^-7 до 10 ^-3 ).Кроме того, хотя невозможно точно определить, какие клубочки активированы, этот подход позволяет одновременно визуализировать индуцированную запахом Ca ²⁺ -активность со всех долей антенн (общая глубина). Следовательно, отслеживается результат общего ответа антеннальных долей, а не ответа от одного или нескольких клубочков. Наконец, у позвоночных было сообщено, что в определенных экспериментальных условиях ГАМК может быть возбуждающим, хотя это противоречие еще не может быть точно объяснено.Более того, кажется, что данный синапс может проявлять тормозящие эффекты при одном протоколе и возбуждающий эффект при другом. Примечательно, что сообщалось, что короткая стимуляция ГАМК является ингибирующей, тогда как во время длительной стимуляции эффект ГАМК может переключаться с ингибирующего на возбуждающий. Интересно, что этот конкретный «эффект переключения» потенциально может объяснить текущую «противоречивую» ситуацию, описанную в этом исследовании: в текущих экспериментальных условиях, в которых использовался относительно длительный стимул запаха (5 с), ГАМК генерирует возбуждающий эффект, тогда как в В предыдущих исследованиях, основанных на коротких (<1 с) раздражителях запаха, ГАМК, по-видимому, является ингибитором.Эта разница в продолжительности стимулов, возможно, может объяснить такие инвертированные или «переключающие эффекты» (Murmu, 2011).

Для изучения поведенческих и функциональных последствий нарушения ГАМКергического сигнального пути были изучены мухи с генетическим нокдауном, специфичным для ГАМК _B R2 (RNAi) ORN, а также мух с компонентом его сигнального пути, G-белком. , блокируется токсином коклюша. Обе группы мух демонстрируют сильный поведенческий дефицит, поскольку мухи с нарушенной адаптацией не могут различать запахи и воздух после 5-минутного воздействия запаха.Интересно, что контрольные мухи меняют свой выбор, предпочитая запах после 5-минутного предварительного воздействия (адаптации), предполагая, что в этих экспериментальных условиях значение запаха изменяется в адаптированном состоянии мухи. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, предполагающими, что адаптация может служить для расширения рабочего диапазона сенсорных систем при различной интенсивности стимулов. Другими словами, адаптация изменяет чувствительность (порог) к запаху, как ранее сообщалось у различных организмов, таких как C.elegans и позвоночных, включая человека. Это явление аналогично другим сенсорным модальностям, например, зрительной системе, где световая адаптация фоторецепторов устанавливает усиление, позволяя видеть как при высоком, так и при низком уровне освещенности. Как сообщалось ранее, запахи могут быть отталкивающими (при высоких концентрациях) или привлекательными (при низких концентрациях). В текущих экспериментальных условиях у контрольных мух запахи отталкивающие. Однако через 5 минут предварительного воздействия мухи адаптируются к этой концентрации запаха, и при тестировании с той же концентрацией запахи, вероятно, будут только слабо восприниматься и, следовательно, могут соответствовать привлекательной «концентрации слабого запаха».В предыдущем исследовании в аналогичных экспериментальных условиях сообщалось, что мух привлекает каждый из этих трех запахов из-за слабой концентрации запаха. Интересно, что обратное предпочтение запаха уже было описано у C. elegans в результате пресинаптических изменений с участием рецептор-подобной гуанилатциклазы (GCY-28) через путь диацилглицерин / протеинкиназа C. Наконец, тот факт, что без предварительного воздействия все группы мух предпочли контрольную группу и оттолкнулись от одорантов, указывает на то, что острота запаха этих мух остается неизменной.Другими словами, каждая из этих групп мух влияет на адаптацию к запаху, а не на его остроту. Эти результаты подтверждают идею о том, что восприятие запаха и адаптация — это действительно два разных и разделимых процесса (Murmu, 2011).

Это исследование продемонстрировало, что процесс адаптации, происходящий конкретно в окончаниях аксонов ORNs, зависит от внутриклеточных запасов Ca ²⁺ через InsP ₃ и рецепторы рианодина. Более того, предоставлены доказательства того, что для этого высвобождения Ca ²⁺ требуется синаптическая передача, поскольку этого не происходит, когда холинергические рецепторы заблокированы (эксперимент с α-бунгаротоксином).Это также требует контроля обратной связи через GAB A, поскольку блокирование передачи сигналов GABA _B в ORN предотвращает или сильно влияет на адаптацию, что позволяет предположить, что задействована локальная нейронная сеть, опосредованная ГАМКергическими нейронами (для более полного обзора см. Схематическую модель синаптической связи). В дополнение к данным визуализации мозга, нокаутация метаботропной ГАМК _B R2 или ее сигнального пути, особенно в ORN, приводит к обонятельному функциональному поведенческому дефициту.Эти результаты в сочетании с результатами блокирования InsP ₃ R или RyR предполагают, что важный процесс обонятельной интеграции, который можно приписать форме нейрональной пластичности и / или кратковременной памяти, происходит непосредственно в ORN сразу после первого нанесение запаха или во время длительного нанесения запаха. Таким образом, этот эффект может напоминать длительную форму адаптации запаха, описанную ранее на клеточном и системном уровнях у позвоночных, включая человека. В более широком смысле предполагается, что у людей хорошо известная «специфическая для запаха временная функциональная аносмия» после длительного воздействия запаха, которая возникает в результате адаптации, также может зависеть от внутриклеточных запасов Ca ²⁺ (Murmu, 2011). ).