Хавал н2 фото: цены, комплектации, тест-драйвы, отзывы, форум, фото, видео — ДРАЙВ

Новости о товаре

• Скидки на воздушный фильтр для KIA Picanto 30 Августа 2013

  Только в онлайн-магазине AvtoALL — специальная интернет-цена на воздушный фильтр для «малютки» KIA Picanto от нидерландского производителя «NIPPARTS». В интернет-магазине самый большой выбор запчастей и компонентов для корейских автомобилей!

Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

de59717ea2516d0d966f52ec558a9dbb

Добавление в корзину

Код для заказа:

Доступно для заказа:

Кратность для заказа:

Отменить

Товар успешно добавлен в корзину

!

В вашей корзине на сумму

Тест-драйв: Haval h3 — TopGear Russia

Если вы еще не слышали о Haval h3, то это… вполне нормально. Все дело в Силе. В силе бренда, от которой, как нам хорошо известно, исходит истинная мощь джедаев.

Да, мы много знаем про Great Wall и даже научились склонять Сhangan. Но Haval пока еще слишком молод для того, чтобы считаться для покупателя крутым. Или тут я как раз заблуждаюсь?

“Хэвейл” – а именно так правильно произносится это имя, с логичным ударением на второй слог – выпестовал и вывел в отдельную люксовую подмарку уже известный нам Great Wall. Нет никакой пестроты или нарочито пафосного хрома – почти вся линейка Haval, целиком состоящая из кроссоверов, выглядит предельно сдержанно и аккуратно. В том числе и h3 – их “энтри-левел”, стартовая модель, что в теории должна познакомить покупателя с новым брендом.

По длине компактный h3 сопоставим с Qashqai и лишь какие-то крохи недотягивает до Tiguan. В Поднебесной он известен уже минимум три года, но поскольку марка добралась до России только в ушедшем 2015-м, нет повода не называть “аш-второй” (кстати, отличное имечко для бэби-кроссовера, не так ли?) новым. Дополнительная прелесть – совсем недавно “кросс” повзрослел, получив автоматическую коробку передач.

Ожидание встречи с чем-то, до боли знакомым по любому вещевому рынку, начинает растворяться буквально с порога. На нем, на пороге, хромированная накладка, перед которой лужицей красного света проецируется на асфальт логотип HAVAL. Световое приветствие – это солидно. Но куда солиднее кроссовер снимается с места.

У большинства компактных “китайцев” подвеска традиционно жесткая. Но у Н2 с ними в этой области мало общего. Передний McPherson с задней многорычажкой – схема тоже, считай, традиционная, но они знают, что такое энергоемкость, и готовы доказывать это на ходу, не боясь. Я чувствую, как мы с h3 кренимся на вираже асфальтовой развязки, но металлический стык эстакады проглатывается мягко и, не побоюсь сравнения, с европейским достоинством. Десяток лет назад похожие ощущения дарили куда более серьезные машины, а теперь – гляди ж ты! Чем не плюс для новичка, пытающегося пробиться на рынок?

А ведь h3 недорог. Ценник на базовую машину не доходит и до миллиона. И если позволить себе известные опциональные вольности – автомат, полный привод (не понимаю, зачем он нужен, ну да пусть), задняя камера и люк в крыше – то такой конфиг все равно выйдет на пару сотен тысяч дешевле главных конкурентов.

Да, от 150 сил убежать не получится: полуторалитровый турбомотор – одновременно и минимум, и максимум для “аш-второго”. Но надо ли бежать, когда полторы сот-ни – как раз то самое число лошадок, к которому в итоге тянется клиент в этом классе? В том-то и дело, что не нужно. Вдобавок, Haval счел нужным объявить, что наддувный “один-и-пять” вполне переваривает бюджетный “девяносто второй” бензин.

Соперник — Suzuki Vitara S
Молод, турбирован и весьма симпатичен. Но дороговат

“«Кольца» готовы, брат. Выезжай”, – выдает мне мойщик с тряпкой. Дизайнерские заигрывания китайской марки рождают ожидаемый эффект: не шибко вдаваясь в детали, публика принимает Haval h3 за кроссовер классом выше и лишь затем, уловив разницу, стремится выяснить, что перед ними: “ку-пять” или “этот-как-его-японец”.

Пока сложно понять, хорошо ли это. Собственное лицо у Haval сформируется не сразу – на это должно уйти время. Пока же марка типично по-азиатски впитывает мировой дизайнерский опыт. Хотя что там дизайнерский – по части езды и комфорта китайскому производителю уже есть что предъявить. Если не учителям из Старого Света, то, по меньшей мере, одноклассникам. Так что, как говорят там, Под Небом, хуаньин, h3…

ТЕКСТ: КОНСТАНТИН НОВАЦКИЙ / ФОТО: АЛЕКСЕЙ БРАВЕРМАН

Haval h3 2017-2018 — фото и цена, видео, характеристики нового Хавал Н2

Модификации Haval h3

Haval h3 1.5 T MT FWD

Haval h3 1.5 T MT AWD

Haval h3 1.5 T AT FWD

Haval h3 – обзор автомобиля

Haval h3 / Хавейл h3

Новый компакт-кроссовер Haval h3 презентован российской публике в рамках ММАС-2014. Это самая младшая модель в гамме китайского премиум-бренда, на которую возлагаются грандиозные надежды. Автомобиль получил привлекательный современный кузов с покатой крышей и выразительными светодиодными фарами. Массивные бампера и крупные колесные арки подчеркивают изящную атлетичность кроссовера. Интересной дизайнерской особенностью Haval h3 является 2-цветная окраска кузова, придающая автомобилю индивидуальный характер. Несмотря на компактную конструкцию, интерьер модели предлагает достаточный запас свободного пространства. Багажный отсек обладает широким проемом для удобства погрузки вещей.

Интерьер Haval h3 выглядит организованно и стильно. Комфорт обеспечивают регулируемые сиденья в высококачественной кожаной обивке. Лакированные вставки под дерево вкупе с мягким пластиком создают приятное впечатлeние от знакомства с салоном китайского кроссовера. Сенсорная мультимедиапанель, эргономично встроенная в центральную консоль, характеризуется высокой функциональностью. В стандартную комплектацию Haval h3 входит парктроник, 6 “эйрбегов”, климатическая система, борткомпьютер с информационным дисплеем, а также полный электропакет. Двигатель предлагается один – 150-сильная турбонаддувная бензиновая установка 1.5 л.

Более подробно о комплектациях Haval h3. В начальной линии исполнения Luxe компактный кроссовер оборудован легкосплавными колесами R18, диодными ДХО и повторителями поворота в зеркалах, алюминиевыми багажными рейлингами, бесключевым доступом, функцией кондиционирования воздуха, обогреваемыми креслами с регулировками, круиз-контролем, рулем с мультифункциями, “амбиетной” подсветкой интерьера, мультимедийным комплексом (ЖК-экран 8 дюймов, Bluetooth, USB, 4 динамика). Следующая, и, по существу, максимaльная комплектация Elite снабжается 2-зонной климат-системой, приводом складывания боковых зеркал, электролюком, стояночным тормозoм с электронным управлением, автозатемняющимся зеркалом салона, дополнительным пакетом освещения, кожаными креслами с расширенными возможностями регулировок. Перечень стандартных функций безопасности Haval h3 состоит из множественных “эйрбегов” (передние, боковые, шторки по всей линии остекления), курсовой устойчивости, камеры заднего обзора, задних парковочных сенсоров, распределения усилия тормозов, датчиков давления шин, функции экстренного торможения, противоугонной сигнализации. В топовой линии оборудования дополнительно имеется функция задержки света (“сопровождение до дома”).

В Украине состоится всеукраинская премьера нового HAVAL h3. Авто,

Компания «Новая Энергия Украины» – официальный дистрибьютор автомобилей HAVAL и Great Wall в Украине – анонсирует всеукраинскую премьеру обновленной версии компактного городского кроссовера HAVAL h3. Официальная презентация нового HAVAL h3 состоится 29 февраля 2020 года во всех дилерских центрах HAVAL.*

«В преддверии весны мы презентуем фейслифтинговую версию HAVAL Н2, которая стала намного технологичней и современней. Слоган «Твоя формула комфорта» выражает не только новый уровень оснащенности модели, но и воплощает новое ощущение стиля жизни. Благодаря изменениям новая версия HAVAL Н2 станет гармоничной находкой для молодой аудитории, а также качественным и разумным выбором для всех тех, кто ценит хорошее оснащение по доступной цене. – рассказывает Борис Ткаленко, директор компании-импортера «Новая Энергия Украины».  По случаю премьеры нового HAVAL Н2 каждого посетителя автосалона HAVAL в марте ожидает приятный сюрприз – сертификат на получение скидки в размере 5% при покупке автомобиля HAVAL Н2 2020 года выпуска».** 

Новый HAVAL h3 – универсальная модель с позиции дизайнерского исполнения и управляемости. Тонкие LED-фары головного света и выразительные линии кузова придают новому HAVAL h3 более спортивный внешний вид, а технологичные опции, такие как поддержка Carplay, система курсовой устойчивости, задний датчик парковки и камера заднего вида создают комфортабельный опыт вождения.

Приобретая новый HAVAL h3, Вы примете оптимальное решение с точки зрения соотношения цены и качества. Цена на новый HAVAL h3 стартует от 417 428 грн.*** Сочетая в себе внедорожные свойства (модель доступна как в переднеприводной, так и полноприводной модификации), высокопроизводительный двигатель (143 л.с.), элегантный интерьер, а также современные технологии, усовершенствованный Н2 позволит Вам почувствовать себя комфортно в любой дорожной ситуации.

Больше информации о новой модели Вы сможете найти на официальном сайте.

HAVAL – это специализированный бренд компании Great Wall Motors по производству внедорожников и кроссоверов. Главное стремление бренда HAVAL – предоставить покупателю автомобиль, который сочетает в себе такие важные качества, как надежность, технологичность, комфорт и безопасность.  Внедорожники HAVAL являются брендом №1 в категории SUV в Китае. В Украине продажи автомобилей HAVAL стремительно растут. Согласно статистике, за 2019 год  было реализовано 434 автомобиля, при этом объем продаж увеличился на 675% по сравнению с аналогичным периодом 2018 года. Основным фактором успешной динамики продаж автомобилей бренда HAVAL на украинском рынке является высокое качество продукта. При покупке HAVAL клиент получает 5 лет гарантийного обслуживания или 100 тыс. км пробега, а также 6 лет гарантии на кузов.

*Время презентации обновленного HAVAL h3 уточняйте в дилерском центре HAVAL в Вашем регионе. Контакты и перечень дилерских центров HAVAL Вы сможете найти на официальном сайте компании http://haval-ukraine.com/dealers.html

**Данный сертификат предоставляет Вам право приобрести автомобиль HAVAL h3 2020 г.в. со скидкой 5% от регулярной стоимости автомобиля, которая установлена в день приобретения автомобиля. Сертификат действителен в период с 1 марта по 31 мая 2020 года. Сертификат активируется только при условии покупки автомобиля HAVAL h3 2020 г.в. Сертификат не может передаваться другим лицам, а также не подлежит обмену на другие товары и услуги. Количество сертификатов ограничено. Предложение дейcтвует в официальной дилерской сети HAVAL. Перечень и контакты дилерских центров Вы найдете на официальном сайте компании http://haval-ukraine.com/dealers.html

***Цена 417 428 грн. указана на модель HAVAL h3 2020 г.в. в комплектации Fashionable с 1,5-л. бензиновым двигателем, 6 МТ и передним приводом. Цена указана по состоянию на 31.01.2020 года. Актуальную цену уточняйте у менеджеров по продаже в автосалоне HAVAL.  

Цитотоксическая активность производного изониазида в раковых клетках молочной железы человека

Abstract

Предпосылки / цель: Изониазид — антибиотик, используемый для лечения туберкулеза. Ранее мы обнаружили, что производное изониазида (E) -N ’- (2,3,4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразид (ITHB4) может быть разработано как новый антимикобактериальный агент путем оптимизации. Мы дополнительно исследовали способность этого соединения по сравнению с зерумбоном подавлять рост клеток рака молочной железы MCF-7.Материалы и методы. Цитотоксичность измеряли с помощью анализа МТТ и дополнительно подтверждали с помощью анализов апоптоза, ROS, клеточного цикла, фрагментации ДНК и цитокинов. Результаты: ITHB4 продемонстрировал более низкую IC ₅₀ по сравнению с зерумбоном в ингибировании пролиферации клеток MCF-7. ITHB4 не проявлял токсичности в отношении нормальных иммунных клеток молочной железы и человека. Анализ апоптоза показал, что ITHB4 в концентрации, равной IC ₅₀ , индуцирует апоптоз клеток MCF-7 и остановку клеточного цикла в фазах sub-G1 и G ₂ / M.ITHB4 запускал накопление внутриклеточных АФК и фрагментацию ядерной ДНК. Секреция провоспалительных цитокинов вызывает воспаление и потенциально иммуногенную гибель клеток. Вывод: ITHB4 обладает почти такими же химиотерапевтическими свойствами, что и зерумбон, в ингибировании роста MCF-7 и, следовательно, обеспечивает основу для дальнейших экспериментов на моделях животных.

Рак груди является наиболее частым онкологическим заболеванием среди женщин, от которого ежегодно страдают 2,1 миллиона женщин (1). В 2020 году в отчете GLOBOCAN указано, что 24.5% случаев рака среди женщин связаны с раком груди, и, по оценкам, 684 996 женщин умерли от рака груди (1). Хотя заболеваемость раком груди выше среди женщин в более развитых регионах, прогнозируется рост заболеваемости почти во всех регионах мира. Ранняя диагностика и агрессивные стратегии лечения / профилактики, такие как хирургическое вмешательство в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией, являются текущими клиническими подходами к борьбе с этим заболеванием (2). Однако рецидив опухоли остается серьезной проблемой при лечении рака груди.Более того, действия широкого спектра химиотерапевтических и лучевых агентов, которые не являются селективными в отношении уничтожения раковых клеток, вызывают у пациентов множество нежелательных побочных эффектов (3). Следовательно, они призвали к неотложным мерам и инновациям в противораковой терапии для эффективного лечения этого заболевания.

В последние годы появляются новые исследования по разработке новых синтетических соединений свинца из различных видов растений и животных, а также неморских и морских микробов в качестве многообещающих методов лечения рака (4).Эти синтетические противораковые соединения реплицируются на молекулярном уровне, чтобы имитировать встречающиеся в природе соединения, с лучшими свойствами, в том числе более устойчивыми, рентабельными и с более высокой селективностью против рака, чем нормальные клетки (5). Некоторые из синтетических противораковых агентов, включая сорафениб и метотрексат, действуют как ингибиторы тирозинкиназы и антиметаболиты, соответственно, которые используются в клинической практике (6). Также появились новые данные, указывающие на то, что антибиотики эффективны не только для лечения бактериальных инфекций, но и для уничтожения раковых стволовых клеток, не нанося вреда нормальным клеткам (7, 8).Например, доксициклин — это антибиотик, используемый для лечения бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевыводящих путей и акне, и текущие результаты показывают, что он также подавляет рост раковых стволовых клеток (7). Благодаря этим экспериментальным данным in vitro и дальнейшим исследованиям в ближайшем будущем будет разработано множество новых противораковых методов лечения. Это привело нас к исследованию потенциальных противораковых свойств одного из синтезированных нами производных изониазида. В нашем предыдущем исследовании мы оценили антимикобактериальную активность нескольких аналогов изониазида (9).Мы определили, что одно из производных изониазида, (E) -N ’- (2,3,4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразид (ITHB4), может быть разработано как новый антимикобактериальный агент путем оптимизации исследований. Это же соединение было также протестировано на линии клеток рака толстой кишки человека HCT 116, показав многообещающие цитотоксические эффекты (10). В этом исследовании мы стремились изучить потенциальные противораковые свойства ITHB4 в отношении клеток рака молочной железы и выяснить возможные молекулярные механизмы, с помощью которых это может происходить в клетках карциномы молочной железы MCF-7.Мы сравнили активность ITHB4 с природным фитохимическим зерумбоном, выделенным из субтропического семейства цветковых растений Zingiberaceae. Зерумбон обладает различными биомедицинскими свойствами, такими как антиоксидантные, противовоспалительные и антипролиферативные (11). Подобно ITHB4, зерумбон также ингибирует рост колоний Mycobacterium tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена (12). Кроме того, известно, что зерумбон проявляет избирательную токсичность в отношении различных линий раковых клеток, включая рак груди (13).Таким образом, мы исследовали, может ли ITHB4 также служить противораковым агентом, подобным зерумбону.

Материалы и методы

Синтез и очистка исследуемых соединений . ITHB4 был приготовлен по методике, описанной в нашей предыдущей работе (14). Структуры аналогов изониазида и путь реакции представлены на рисунках 1 и 2. Соединение свинца получали реакцией 2,3,4-тригидроксибензальдегида (1,0 экв.) С изониазидом (1,0 экв.) В смеси этанол / вода.После перемешивания в течение 1-3 часов при комнатной температуре полученную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток, очищенный промыванием холодным этанолом и этиловым эфиром, давал чистое производное. Монокристаллы коричневого цвета, пригодные для рентгеноструктурного анализа, были получены перекристаллизацией из этанола. Химическая структура соединения свинца была охарактеризована с помощью различных спектроскопических методов, а окончательная структура была подтверждена рентгеновской кристаллографией (12).

Структуры (E) -N ’- (2, 3, 4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразида (ITHB4).

Синтетический путь, используемый для получения (E) -N ’- (2, 3, 4-тригидроксибензилиден) изоникотиногидразида (ITHB4).

Соединение свинца состоит из молекулы ITHB4 и двух кристаллизационных молекул воды (рис. 1). Молекула основания Шиффа существует в E-конфигурации по отношению к ациклической связи C7 = N3 [C7 = N3 = 1,2921 (10) Å; торсионный угол N2 — N3 — C7 — C8 = 178,85 (7) °]. Внутримолекулярная водородная связь O2-h2O2 ··· N3 образует шестичленное кольцо, образуя мотив кольца S (6).Пиридиновое кольцо с последовательностью атомов C1 / C2 / N1 / C3 / C4 / C5 по существу является плоским, с максимальным отклонением 0,0119 (8) Å при атоме C5. Между пиридиновым и бензольным кольцами имеется небольшой наклон, на что указывает двугранный угол, образованный 7,30 (4). Все длины связей и углы соответствуют тем, которые наблюдаются в близкородственных изониазидных структурах.

В кристаллической упаковке молекулы воды играют важную роль в формировании структуры с водородными связями. Соседние молекулы связаны в двумерные массивы, параллельные плоскости (101), межмолекулярными O3 — h2O3 … N1, O4 — h2O4 … O1W, N2 — h2N2 … O2W, O1W — h2W1 … … O1, Водородные связи O2W — h3W2 … O4 и C7 — H7A … O2W.Эти массивы дополнительно связаны межмолекулярными водородными связями O1W-h3W1 ··· O2W, O2W-h2W2 ··· O2 и C4-h5A ··· O1 в трехмерную протяженную структуру. Слабые межмолекулярные π – π ароматические стэкинг-взаимодействия с участием пиридинового и бензольного колец [Cg1 ··· Cg2 = 3,5627 (5) Å, код симметрии: –x + 2, –y + 1, –z + 2] стабилизируют кристалл. состав.

ITHB4 спектральные данные: бледно-коричневое твердое вещество; УФ (λmax): 331 нм, ИК (см-1; KBr) 3383 (OH), 3256 (NH), 1659 (C = O), 1618 (C = N). 1H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) d: 12.18 (с, 1H, –CONH), 11,29 (с, 1H, –OH), 9,58 (с, 1H, –OH), 8,80-8,78 [дд, 2H, J = 5,92 Гц, 2,2 Гц, (Pr – a –CH)], 8,56 (с, 1H, OH), 8,49 (с, 1H, N = CH), 7,84–7,82 [дд, 2H, J = 5,88 Гц, 2,2 Гц, (Pr – α – CH)], 6,85–6,82 [д, 1H, J = 11,4 Гц (Ar – H)], 6,42–6,39 [д, 1H, J = 11,28 Гц, (Ar – H)]. 13С ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ; 162,50, 152,36, 151,14, 149,97, 148,58, 141,05, 133,70, 122,23, 111,81, 108,76. МС – ESI m / z (%) — [M + Na] + 296,10 (100). Анальный. Расчетное для C13h21 N3 O4 (273,07): C 57,14; H 4,06; N 15,38; найдено: C 57,11; Н, 4.09; N 15,36.

Химия и реактивы . Для синтеза ITHB4 2,3,4-тригидроксибензальдегид и изониазид были получены от Millipore Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Для реакции использовали растворители чистоты для ВЭЖХ. Реагенты и все растворители были аналитически чистыми и использовались без дополнительной очистки. Предварительно покрытые алюминиевые листы силикагель 60 F254 (Merck, Дармштадт, Германия), пластины ТСХ использовали для контроля за ходом реакции, используя дихлорметан / метанол в качестве подвижной фазы.Все использованные химические вещества и растворители были наивысшего доступного аналитического качества. Расходные материалы и среды для клеточных культур, фетальная бычья сыворотка (FBS), пируват натрия, заменимые аминокислоты, пенициллин / стрептомицин и ДМСО были получены от Sigma Aldrich (Малайзия). Зерумбон (положительный контроль) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), использованные в этом исследовании, были приобретены у Sigma Aldrich (Малайзия).

Культура клеток . Клеточная линия эстроген-зависимой карциномы молочной железы (MCF-7) и линия неканцерогенных эпителиальных клеток (MCF10A) были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США).Клетки MCF10A культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) / F12 Ham’s, с добавлением 10% FBS (Sigma), 10 нг / мл эпидермального фактора роста (Sigma), 10 мкг / мл инсулина (Sigma), 0,5 мг. / мл гидрокортизона (Sigma), 100 нг / мл холерного токсина (Sigma), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Между тем, клетки MCF-7 размножали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.Все эти клетки размножали в увлажненном инкубаторе 37 ° C с 5% CO ₂ .

Выделение и поддержание мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) . Выделение PBMC из лейкоцитов проводили, как описано ранее (15). Вкратце, 10 мл цельной крови получали от каждого здорового человека в пробирки с гепарином литиевым продуктом BD Vacutainer (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), и PBMC выделяли центрифугированием в градиенте плотности над Ficoll-Paque TM (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).Клетки ресуспендировали в замораживающей среде (10% ДМСО в 90% фетальной бычьей сыворотке (FBS) (Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) и криоконсервировали в жидком азоте до использования. Эта часть исследования была проведена после одобрения Комитет по медицинской этике (MEC) Медицинского центра Университета Малайи (каталожный номер 938.42). Письменное согласие было получено от всех участников перед включением в исследование.

Первичная культура клеток . PBMC размножали в среде RPMI1640 с добавлением HEPES буфер (25 мМ), L-глутамин (2 мМ), пенициллин (100 Ед / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), пируват натрия (1 мМ), гентамицин (1 мг / мл) (все закуплено у Life Technologies, Виктория, Австралия) и 10% FBS (Gibco).IL-2 был добавлен к культуре PBMC для увеличения пролиферации клеток. Эти клетки размножали в увлажненном инкубаторе 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 24 часов.

Анализ цитотоксичности in vitro ITHB4 в клетках MCF-7 и MCF10A . Половинную максимальную ингибирующую концентрацию IC ₅₀ (, т.е. . концентрации, при которых рост клеток снижался наполовину) ITHB4 на клетках MCF-7 определяли с использованием анализа МТТ. Клетки высевали в трех экземплярах в 96-луночный планшет при плотности 2 × 10 ⁵ клеток / мл в 100 мкл культуральной среды.ITHB4 растворяли в ДМСО в концентрации 1 мг / мл, из чего готовили рабочие растворы в полной культуральной среде перед обработками. Эти рабочие растворы готовили серийным разведением как таковых 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50 и 25 мкг / мл. Необработанные клетки MCF-7 использовали в качестве отрицательного контроля в этом эксперименте. Клетки инкубировали в течение 24 и 48 часов соответственно, после чего их жизнеспособность оценивали, добавляя к клеткам 20 мкл МТТ, 5 мг / мл, в темноте. Затем планшеты накрывали алюминиевой фольгой и инкубировали еще 4 часа.Затем всю среду удаляли и к клеткам добавляли 100 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Впоследствии оптическую плотность считывали при длине волны 570 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Способность ITHB4 к ингибированию роста клеток определяли в терминах IC ₅₀ . Зерумбон использовался на протяжении всего этого исследования в качестве положительного контроля для сравнения активности ITHB4 в ингибировании роста клеток MCF-7. Кроме того, был определен IC ₅₀ зерумбона. Аналогичный протокол был повторен с MCF10A.

Анализ цитотоксичности ITHB4 in vitro на культуре PBMC . Чтобы проверить уровень токсичности 97,55 мкг / мл ITHB4 на иммунных клетках человека, PBMC высевали по 1 × 10 ⁵ клеток / лунку в 96-луночный планшет и инкубировали в течение ночи. На следующий день клетки культивировали с ITHB4 при концентрации IC ₅₀ в течение 48 часов. МТТ добавляли к клеткам в темноте за 4 ч до прекращения эксперимента путем добавления ДМСО. Оптическую плотность считывали при длине волны 570 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.Цитотоксичность зерумбона при концентрации IC ₅₀ исследовали с использованием аналогичных протоколов.

Обнаружение апоптоза . Апоптотический эффект ITHB4 и зерумбона на клетки MCF-7 при концентрациях IC ₅₀ определяли с использованием набора для апоптоза Tali ^® , содержащего аннексин V Alexa Fluor ^® 488 и йодид пропидия (PI) от ThermoFisher Scientific (Waltham , Массачусетс, США). Вкратце, перед анализом клетки обрабатывали IC ₅₀ ITHB4 и зерумбоном в течение 48 часов.Клетки собирали из 6-луночных планшетов с использованием трипсина, центрифугировали при 300 × g в течение 10 мин, ресуспендировали в ABB (связывающий буфер аннексина V) и инкубировали с аннексином V Alexa Fluor 488 при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин. После центрифугирования при 300 × g в течение 5 минут клетки снова ресуспендировали в ABB и инкубировали с PI при комнатной температуре в темноте в течение 5 минут. Клетки немедленно исследовали с использованием цитометра Tali ^® Image-Based Cytometer (ThermoFisher). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FCS Express Research Edition (версия 4.03; De Novo Software, Нью-Джерси, Нью-Джерси, США) и выражается как процент клеток в каждой популяции, такой как живые, мертвые и апоптотические клетки. Также был получен визуальный результат, при котором апоптотические клетки окрашивались в зеленый цвет из-за Аннексина V Alexa Fluor ^® 488, мертвые клетки окрашивались как красным PI, так и зеленым Аннексином V Alexa Fluor ^® 488, а живые клетки не окрашивались ни одним из них. PI или аннексин V Alexa Fluor ^® 488.

Анализ клеточного цикла . Эффекты ITHB4 и зерумбона на распределение клеток MCF-7 в клеточном цикле изучали с помощью BD BrdU FITC Assay.Их обрабатывали 97,60 мкг / мл и 126,7 мкг / мл ITHB4 и зерумбона, соответственно, в течение 48 часов с последующей инкубацией с 10 мкМ бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 30 минут. Затем клетки отделяли трипсином и инкубировали с 20 мкл анти-BrdU-FITC в течение 20 минут, а также с 2,5 мкл 7-аминоактиномицина D (7-AAD) в течение 15 минут в соответствии с инструкциями производителя (BrdU Flow Kit, BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США). Анализ выполняли с использованием проточного цитометра BD FACSCanto II (BD Biosciences) и FlowJo v7.6.5 64-битное программное обеспечение (Treestar, Ashland, OR, США).

Анализ активных форм кислорода (АФК) . Определение уровней ROS после инкубации клеток MCF-7 с IC ₅₀ ITHB4 или zerumbone проводили в соответствии с инструкциями производителя (Mitosciences, DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit; Mitoscience / Abcam, Cambridge, UK). В наборе используется 2 ’, 7’-дихлорфлуоресцеиндиацетат (DCFDA) — реагент, проникающий в клетки, — флуорогенный краситель, который измеряет гидроксил, пероксил и любые другие внутриклеточные ROS.После диффузии в клетку DCFDA деацетилируется клеточными эстеразами до нефлуоресцентного соединения, которое впоследствии окисляется внутриклеточными ROS до DCF. DCF обладает высокой флуоресценцией и может быть обнаружен с помощью флуоресцентной спектроскопии при 495 нм (возбуждение) и 529 нм (эмиссия). Вкратце, клетки MCF-7 высевали в течение ночи в 96-луночный планшет в 100 мкл культуральной среды в темноте. В день эксперимента клетки инкубировали с IC ₅₀ ITHB4 и зерумбоном в течение 48 часов.На следующий день клетки инкубировали с 25 мкМ DCFH-DA в темноте в течение 45 мин. Позже DCFH-DA удаляли, а клетки промывали 1 × буферным раствором. Флуоресценцию, исходящую от клеток каждой лунки, измеряли и регистрировали при 485 нм (возбуждение) и 535 нм (эмиссия) с использованием считывающего устройства для микропланшетов Varioskan Flash (Thermo-Scientific).

Анализ фрагментации ДНК . Чтобы определить влияние ITHB4 и zerumbone на целостность ДНК раковых клеток, был проведен анализ фрагментации ДНК, при котором клетки MCF-7 обрабатывали 97.60 мкг / мл и 126,7 мкг / мл ITHB4 или зерумбона соответственно в течение 48 часов. Затем клетки собирали и центрифугировали при 650 × g в течение 5 минут при 4 ° C. Полученные осадки собирали, и ДНК экстрагировали с использованием коммерческого мини-набора QIAamp DNA (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Количество ДНК в каждом образце измеряли и 10 мкг ДНК подвергали электрофорезу в 1,2% (мас. / Об.) Агарозном геле. Гель визуализировали с использованием источника УФ-света и отображали с помощью системы документации гелей Gel Doc XR (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK).

Анализ цитокинов Th2 / Th3 / Th27 . Для исследования секреции различных цитокинов в супернатанте клеток MCF-7, обработанных концентрацией ITHB4 или зерумбона IC ₅₀ , коммерчески доступный набор BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Th2 / Th3 / Th27 Cytokine kit (BD Biosciences) использовался в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, супернатант культуры собирали и фильтровали через фильтр Steriflip ^® с размером пор 0,22 мкм (Millipore, Billerica, MA, USA).Супернатанты необработанных клеток использовали в качестве отрицательного контроля. Анализ определяет уровни IL-2, IFN-, γ , TNF-, α , IL-6, IL-10, IL-4 и IL-17A. Образцы были получены на FACSCanto II (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения для массивов FCAP (BD Biosciences).

Статистический анализ . Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), а n относится к количеству независимых экспериментов. Уровни значимости для сравнений между двумя или более независимыми выборками определяли с использованием двустороннего непарного критерия Стьюдента t .Различия считались достоверными при * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001. Группы сравнивали с помощью одностороннего или двустороннего дисперсионного анализа, и для исследования значимости применяли апостериорный тест Бонферрони с использованием GraphPad Prism Version 8.0 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США).

Результаты

Уровень цитотоксичности ITHB4 . МТТ-анализ проводили для определения цитотоксичности синтезированного соединения против линии клеток рака молочной железы MCF-7 в два разных момента времени: 24 часа и 48 часов (рис. 3).ITHB4 значительно ингибировал рост клеток MCF-7 при всех концентрациях. Однако было обнаружено, что IC ₅₀ ITHB4 ниже через 48 часов (97,55 мкг / мл) по сравнению с 24 часами (142 мкг / мл), и он был статистически значимым при значении p , равном 0,0072, что указывает на то, что ITHB4 более эффективно ингибировал клетки MCF-7 в более длительный момент времени (рис. 3А). Между тем, зерумбон подавлял рост клеток MCF-7 при более низком значении IC ₅₀ через 48 часов (126,7 мкг / мл) по сравнению с 24 часами (IC ₅₀ : 127 мкг / мл), однако статистической разницы не было. значащий со значением p , равным 0.0649 (Рисунок 3B). На основании этих данных для дальнейшего анализа был выбран период лечения в 48 часов для ITHB4 и zerumbone. Более низкая концентрация ITHB4 по сравнению с зерумбоном требовалась для снижения роста клеток MCF-7 наполовину (97,55 против ,126,7 мкг / мл) и статистической значимости разницы между выживаемостью клеток MCF-7 после 48-часовой обработки ITHB4. и zerumbone был маргинальным с p -значение 0,048 (Рисунок 3C). И ITHB4, и зерумбон не проявляли цитотоксичности в отношении нормальных клеток молочной железы и PBMC при их соответствующей концентрации IC ₅₀ (фигура 3D, E, F и G).

Сравнительная цитотоксическая активность ITHB4 и зерумбона на MCF-7, MCF10A и культуре мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) через 24 и 48 часов. (A) Дозозависимое ингибирование выживания клеток MCF-7, обработанных ITHB4, как определено с помощью анализа MTT. Различные периоды лечения по-разному влияют на эффективность ITHB4 in vitro. (B) Дозозависимое ингибирование выживания клеток MCF-7, обработанных зерумбоном, как определено с помощью анализа MTT. Различные периоды лечения по-разному влияют на эффективность лечения зерумбоном in vitro.(C) Дозозависимое ингибирование выживания клеток mCF-7 после обработки ITHB4 или зерумбоном в течение 48 часов. (D) Дозозависимый эффект обработки ITHB4 в течение 48 часов на выживаемость клеток MCF10A, как определено с помощью анализа МТТ. ITHB4 не обнаружил явного ингибирования роста клеток MCF10A. (E) Дозозависимый эффект обработки ITHB4 в течение 48 часов на выживаемость PBMC, как определено с помощью анализа MTT. ITHB4 не показал очевидного ингибирования пролиферации PBMC. (F) Дозозависимый эффект обработки зерумбоном в течение 48 часов на выживаемость клеток MCF10A, как определено с помощью анализа МТТ.Zerumbone не показал очевидного ингибирования роста клеток MCF10A. (G) Дозозависимый эффект лечения зерумбоном в течение 48 часов на выживаемость PBMC, как определено с помощью анализа MTT. Zerumbone не показал очевидного ингибирования пролиферации культуры PBMC. Кривые «доза-ответ» получали с использованием модели логистического нелинейного регрессионного анализа. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для повторяющихся образцов как минимум двух независимых экспериментов.

ITHB4 индуцирует апоптоз в клетках MCF-7 .Для исследования роли апоптоза в противоопухолевом эффекте ITHB4 использовали набор Tali ^® Apoptosis Kit, содержащий аннексин V Alexa Fluor ^® 488 и PI. Результаты показали, что при его концентрации IC ₅₀ ITHB4 индуцировал апоптоз клеток MCF-7 через 48 часов обработки; однако этот эффект не превышал эффект зерумбона, в результате чего обработка зерумбоном с концентрацией IC ₅₀ приводила к скорости апоптоза 35% по сравнению с ITHB 4 (26%) (рис. 4A и B).

Процент апоптотических клеток в необработанных и обработанных клетках MCF-7. А) ITHB4 индуцирует апоптоз клеток MCF-7 после 48 часов обработки. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (SD) 3 независимых экспериментов. Статистический анализ считается значимым, если * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001. B) Репрезентативный визуальный результат цитометра на основе изображений Tali®, показывающий апоптотические клетки, окрашенные в зеленый цвет из-за аннексина V Alexa Fluor ^® 488 (a и d), мертвые клетки, окрашенные как красным PI, так и зеленым аннексином V Alexa Fluor ^® 488 (b), и живые клетки, не окрашенные ни PI, ни аннексином V Alexa Fluor ^® 488 (c).

ITHB4 индуцировал остановку клеточного цикла G ₂ / M . Окрашивание BrdU FITC и проточно-цитометрический анализ были выполнены для исследования распределения фаз клеточного цикла клеток MCF-7, обработанных концентрацией ITHB4 IC ₅₀ в течение 48 часов (рис. 5A). Наблюдалось значительное увеличение на 39,6% доли обработанных ITHB4 клеток в фазе G ₂ / M ( p <0,001), тогда как доля необработанных клеток составляла только 15,2%. Доля клеток, обработанных зерумбоном, была немного увеличена на 20.5% (рисунок 5B). Между тем, популяция клеток в S-фазе была уменьшена (3,5%) с помощью ITHB4 и (1,5%) зерумбона по сравнению с необработанными клетками (25%). Напротив, высокая доля обработанных зерумбоном клеток была обнаружена в основном в фазе G0 / G1 (60,2%) по сравнению с необработанными клетками MCF-7 (51%) и клетками, обработанными ITHB4 (50%) ( p <0,001) . Кроме того, доля клеток в фазе суб-G0 / G1, которая косвенно представляет апоптотические клетки, также резко увеличилась с 2% в необработанных клетках до 6.0% и 11,3% в клетках, обработанных 97,60 мкг / мл и 126,7 мкг / мл ITHB4 и зерумбоном, соответственно ( p <0,01). Эти результаты предполагают, что ITHB4 проявляет значительный противоопухолевый эффект и приводит к остановке клеточного цикла MCF-7 в фазе G ₂ / M, тогда как зерумбон, по-видимому, останавливает пролиферацию клеток MCF-7 в фазе G0 / G1.

Распределение клеточного цикла необработанных и обработанных клеток MCF-7. A) График разброса результатов проточного цитометрического анализа необработанных клеток MCF-7, клеток, обработанных концентрацией ITHB4 IC ₅₀ , и клеток, обработанных концентрацией зерумбона IC ₅₀ .B) Количественный анализ показал остановку клеточного цикла MCF-7 в фазе G2 / M после обработки ITHB4. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение 3 независимых экспериментов. Статистический анализ считается значимым, если * p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001.

ITHB4 индуцировал фрагментацию ДНК в клетках MCF-7 . Деградация ДНК в виде лестницы является признаком гибели клеток, вызванной АФК. Мы наблюдали, что ITHB4 ингибировал пролиферацию MCF-7 в фазе G ₂ / M клеточного цикла и впоследствии увеличивал количество клеток в фазе суб-G1, предполагая индукцию апоптоза.Затем мы определили, индуцирует ли ITHB4 фрагментацию ДНК в клетках MCF-7. Как показано на фиг. 6, ITHB4 запускал образование и появление апоптотических фрагментов ДНК на агарозном геле, подтверждая, что цитотоксический эффект ITHB4 на клетки MCF-7 опосредован апоптотическим путем. Точно так же зерумбон также индуцировал фрагментацию ДНК в клетках MCF-7.

Изображение геля 1,2% агарозы, показывающее, что ITHB4 вызывает фрагментацию ДНК. Дорожка 1: лестница ДНК 1000 п.н., Дорожка 2: необработанные клетки MCF-7, Дорожка 3: клетки, обработанные IC _{50 с концентрацией ITHB4} , Дорожка 4: необработанные клетки MCF-7 и Дорожка 5: обработанные клетки MCF-7 с концентрацией зерумбона IC ₅₀ .

Производство клеточных активных форм кислорода (АФК) в клетках, обработанных ITHB4 . Избыточный уровень АФК в клетках может вызвать повреждение белков, нуклеиновых кислот, липидов, мембран и органелл, что может привести к апоптозу. Мы наблюдали значительное увеличение продукции ROS в клетках, обработанных ITHB4, по сравнению с zerumbone (рис. 7), предполагая, что эффекты ITHB4 могут происходить через через активацию событий, инициированных митохондриями.