Фото лады кросс: LADA Vesta SW Cross 2021

Содержание

Детальный обзор авто Лада Веста СВ Кросс

Lada Vesta SW Cross – отечественный автомобиль для современных реалий

Компания АвтоВАЗ презентовала обновленную модель в 2017 году. С тех пор она стала фаворитом авторынка благодаря стильному дизайну и доступности для покупателей. Экстерьер подчеркивает динамические характеристики автомобиля, который напоминает спорткар. Машина предназначена для городской среды, но и на загородной трассе не уступает другим представителям своего сегмента. Производитель предлагает комплектации Luxe, Comfort и другие, которые отличаются набором встроенной электроники и мультимедиа. Даже базовая конфигурация оснащена всем необходимым для комфорта водителя и пассажира, например, есть регулируемый подогрев сидений и эргономичные подголовники, которые снижают нагрузку на позвоночник.

Модель Веста СВ Кросс – выбор российских автолюбителей

К основным техническим характеристикам авто можно отнести четырехцилиндровый двигатель с распределенным впрыском бензина объемом до 1,8 л. Мощность автомобиля может достигать 122 л. с., чего будет достаточно для города или проселочной дороги.

Даже опытные водители отмечают, что Vesta SW Cross от Лада – оптимальное сочетание комфорта и качества. Среди преимуществ пользователи называют:

  • отличную звукоизоляцию салона, минимизирующую шумы даже на оживленных магистралях;
  • вместительный багажник с удобным органайзером, который позволяет организовать систему хранения и разместить необходимый груз;
  • активные системы безопасности, стабилизирующие авто на дороге во время поворотов и обгона.

С помощью Autospot пользователи могут приобрести универсал Лада Веста Кросс и получить уникальный пакет бонусов и специальных предложений от проверенных дилеров. Также каждый получит до 12% скидки на любую комплектацию.

Информация о модели LADA Vesta SW Cross 2015 – н.в., I: технические характеристики, отзывы и фотографии авто. 9 и более обзоров на автомобиль Лада Веста в кузове универсал. Смотрите видео и фото, а также читайте отзывы о машине. Купить авто с пробегом в Москве на Autospot.ru!

LADA Granta Cross – Обзор модели, фото – Первый Лада Центр, Краснодар.

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Classic (21941-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей

• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Comfort (21941-A1-X31)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления

• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Comfort (21947-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)

• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Comfort (21947-A1-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений

• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Luxe (21947-A2-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый

• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Luxe (21947-A2-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.

• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние

• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14''

Новая LADA Vesta SW Cross в салоне дилера

Кузов
Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах, л 480 / 825 480 / 825 480 / 825
Расположение двигателя переднее поперечное переднее поперечное переднее поперечное
Тип кузова / количество дверей универсал / 5
универсал / 5
универсал / 5
Количество мест 5 5 5
Длина / ширина / высота, мм 4424 / 1785 / 1537 4424 / 1785 / 1537 4424 / 1785 / 1537
База, мм 2635 2635 2635
Колея передних / задних колес, мм 1524 / 1524 1524 / 1524 1524 / 1524
Дорожный просвет, мм 203 203 203
Колесная формула / ведущие колеса 4 х 2 / передние 4 х 2 / передние 4 х 2 / передние
Двигатель
Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин. 83 (113) / 5500 78 (106) / 5800 90 (122) / 5900
Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин. 152 / 4000 148 / 4200 170 / 3700
Код двигателя h5M 21129 21179
Топливо бензин 92 бензин 92 бензин 92
Тип двигателя бензиновый бензиновый бензиновый
Система питания впрыск топлива с электронным управлением впрыск топлива с электронным управлением впрыск топлива с электронным управлением
Количество, расположение цилиндров 4, рядное 4, рядное 4, рядное
Рабочий объем, куб. см 1598 1596 1774
Динамические характеристики
Максимальная скорость, км/ч 170 178 180
Время разгона 0-100 км/ч, с 12,2 12,6 11,2
Расход топлива
Смешанный цикл, л/100 км 7,4 7,5 7,9
Городской цикл, л/100 км 9,6 9,7 10,7
Загородный цикл, л/100 км 6,1 6,0 6,4
Масса
Снаряженная масса, кг 1280...1350 1280...1350 1280...1350
Технически допустимая максимальная масса, кг 1730 1730 1730
Максимальная масса прицепа без тормозной системы / с тормозной системой, кг 600 / 900 600 / 900 600 / 900
Объем топливного бака, л 55 55 55
Трансмиссия
Тип трансмиссии АТ 5МТ 5МТ
Передаточное число главной передачи 3,9 3,9 4,2
Подвеска
Передняя независимая, типа Макферсон, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами и стабилизатором поперечной устойчивости независимая, типа Макферсон, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами и стабилизатором поперечной устойчивости независимая, типа Макферсон, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами и стабилизатором поперечной устойчивости
Задняя полузависимая, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами полузависимая, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами полузависимая, пружинная, с телескопическими гидравлическими или газонаполненными амортизаторами
Рулевое управление
Рулевой механизм шестерня-рейка шестерня-рейка шестерня-рейка
Шины
Размерность 205/50 R17 (93/89, W/V) 205/50 R17 (93/89, W/V) 205/50 R17 (93/89, W/V)

дилер LADA в г. Москва (Москва и МО)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Боковые подушки безопасности
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров
• Автовыключение света фар
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка потолка черного цвета
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет черный
• Отделка руля кожей
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый (в Comfort для АТ)
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (4,3'' монохромный дисплей, FM/AM с функцией RDS, USB, SD-карта, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Боковые подушки безопасности
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров
• Автовыключение света фар
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый (в Comfort для АТ)
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Боковые подушки безопасности
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Задний подлокотник
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров
• Розетка USB для задних пассажиров
• Автовыключение света фар
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Наружные зеркала с функцией электроскладывания
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Боковые подушки безопасности
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля кожей
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров
• Автовыключение света фар
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый (в Comfort для АТ)
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Боковые подушки безопасности
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары с функцией освещения поворота
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Задний подлокотник
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Отделка руля кожей
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Футляр для очков
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров
• Розетка USB для задних пассажиров
• Автовыключение света фар
• Атмосферная подсветка салона
• Подсветка мест входа-выхода в передних дверях

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Усиленная тонировка задних стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Наружные зеркала с функцией электроскладывания
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый (в Comfort для АТ)
• Подогрев задних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Датчики дождя и света
• Климат-контроль
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (4,3'' монохромный дисплей, FM/AM с функцией RDS, USB, SD-карта, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (4,3'' монохромный дисплей, FM/AM с функцией RDS, USB, SD-карта, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка потолка черного цвета
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет черный
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (4,3'' монохромный дисплей, FM/AM с функцией RDS, USB, SD-карта, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Крыша кузова черного цвета
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Подогрев передних сидений 3х уровневый (в Comfort для АТ)
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Аудиосистема (4,3'' монохромный дисплей, FM/AM с функцией RDS, USB, SD-карта, AUX, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира с функцией отключения
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Автоматическое запирание дверей при начале движения
• Автоматическое включение аварийной сигнализации при экстренном торможении
• Автоматическое отпирание дверей и включение аварийной сигнализации при столкновении
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Дисковые тормоза задних колес
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC) с функцией отключения
• Противобуксовочная система (TCS)
• Система помощи при трогании на подъеме (HSА)
• Защита двигателя и подкапотного пространства

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов
• Центральный подлокотник с боксом
• Заднее сиденье с раскладной спинкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек водителя и пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Розетка 12V для задних пассажиров

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте и по вылету рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте и поясничной поддержкой
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Обогреваемый руль с кожаной отделкой
• Подогрев передних сидений 3х уровневый
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Kамера заднего вида с динамическими линиями
• Кондиционер
• Охлаждаемый вещевой ящик
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Мультифункциональное рулевое колесо
• Мультимедийная система LADA EnjoY Pro с встроенными сервисами Яндекс.Авто (8’’ TFT-IPS ёмкостный HD дисплей, FM, 2 USB, Bluetooth, голосовое управление, Hands Free со сдвоенным микрофоном и функцией шумоподавления, Apple CarPlay, Android Auto), 6 динамиков

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота
• Наружные зеркала в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Декоративная насадка выпускной трубы
• 17'' легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 15''

Появились первые фотографии обновленного универсала Lada Vesta SW Cross

Прототип LADA Vesta SW Cross FL
Фото AvtoVAZ News

Иван Бахарев, 15 февраля 2021, 14:09

«АвтоВАЗ» продолжает тестировать обновленные LADA Vesta на дорогах Тольятти. На этот раз в объектив фотошпионов попал свежесобранный прототип «внедорожного» универсала Vesta SW Cross. Фотографии новинки опубликовал паблик «AvtoVAZ News» в социальной сети «ВКонтакте».

В отличие от других прототипов и «обычного» универсала Vesta SW, чей снимок «Автоновости дня» выкладывали ранее, автомобиль на фото имеет увеличенный дорожный просвет, решетку радиатора с «сотовой» структурой (такую же, как на обновленной Largus Cross) и менее плотный камуфляж, сквозь который просматриваются контуры защитного пластикового «обвеса».

Прототип LADA Vesta SW Cross FL. Фото AvtoVAZ News
Прототип LADA Vesta SW Cross FL. Фото AvtoVAZ News
Прототип LADA Vesta SW Cross FL. Фото AvtoVAZ News

Кроме того, на свежих снимках можно точно убедиться в том, что рестайлинговая Vesta сохранит округлые фары, но при этом они станут чуть уже нынешних и впервые получат светодиодную «начинку» (вероятно, только в топовых комплектациях).

В интерьере Vesta FL (Facelift) ожидаются новые дверные карты, пересмотренная приборная панель, блок климат-контроля от Renault Arkana (с тремя шайбами и подсветкой) и новая мультимедийная система, которая, по неподтвержденным пока данным, получит крупный вертикальный тачскрин.

Об изменениях в «технике» вазовского флагмана пока можно только догадываться, но в гамме двигателей должны остаться прежние бензиновые «атмосферники» 1.6 мощностью 106 и 113 лошадиных сил, а также безнаддувный 122-сильный мотор 1.8.

Полноценное серийное производство обновленной LADA Vesta должно начаться в конце 2021 года, а к дилерам долгожданная новинка поступит только в следующем году.

Источник: AvtoVAZ News

Lada Vesta Cross Black | Motor1.com Фотографии

Россия

Международные редакции

  • Edition: USA / Global
  • Édition: France
  • Edizione: Italia
  • Ausgabe: Deutschland
  • Версия: Россия
  • Edição: Brasil
  • Edition: UK
  • النسخة: الشرق الأوسط
  • EDİSYON: TÜRKİYE
  • Edición: España
  • Edition: Magyarország
  • Edition: Indonesia

Лада Веста СВ Кросс (Lada Vesta SW Cross) 2019-2020 универсал и седан

Концерн ВАЗ начиная с 2014 года запустил в серию модели нового поколения, а именно Лада Веста в различных вариациях кузова. Наиболее популярная ныне модель, под названием Лада Веста СВ Кросс 2019-2020 года занимает лидирующее положение по продажам. В представленной статье подробно разберём дизайн Лада Веста по фото, как оформили интерьер, какие особенности нас ожидают в техническом плане, а также, какие комплектации Лада Веста будут доступны российским покупателям. Кроме того, в конце обзора вас ожидают оставленные на Лада Веста 2019-2020 года отзывы владельцев, какое мнение сложилось у покупателей за время пользования.

Новости Лада Веста, тест драйвы помогают более наглядно и правдиво изучить машину. Поэтому в конце статьи будет представлен подробный видеоочерк от ведущих автомобильных экспертов.

Дизайн

Лада Веста СВ Кросс по фото, как и её обычная версия седан, практически идентична по оформлению, за исключением, конечно, задней части. В остальном кузов обладает похожими линиями, с оригинальной и эффектной структурой. Преобладает подтянутый, и даже спортивный стиль, с выдержанными пропорциями.

Новая Лада Веста от 2019-2020 года в обеих модификациях это скорей демонстрация компанией своих идей, наработок, которые она внедряет в жизнь. Удачно продуманная эргономика Лада Веста СВ в 2019-2020 в новом кузове, с оригинальностью, практичностью и на удивление динамичностью.

Экстерьер

Впервые Lada Vesta показался на фото ещё в далёком 2014 году, когда была представлена премьера. С тех пор, год за годом компания вносила определённое количество изменений в машину, представив сначала в 2015, а потом в 2016 году седан Lada Vesta Cross и Лада Веста Кросс универсал, в том числе с характерным внедорожным обвесом.

Наиболее яркой и броской кажется передняя часть, за счёт рельефной крышке капота, скульптурного бампера, модной оптики, решётке радиатора. Но, главное достоинство «передка» это обыгранные мотивы буквы «Х». В продолжение «икс» темы, на боковинах Lada Vesta встречаем характерные выштамповки с парящими линиями.

Удачно сформированная корма в обеих версиях выглядит спортивно и подтянуто, добавляя силуэту машины спортивности и динамичности. В зависимости от комплектации Lada Vesta, например, Exclusive версия получает дополнительные хромированные молдинги, добавляя дороговизны автомобилю.

Фото новой Лады Весты СВ Кросс отчётливо показывает насколько кардинально решили изменить корму в отличие от седан версии. Огромный нависающий спойлер, скошенная крышка, заваленные задние стойки, напоминают мотивы «англичан». Смотрится «тонированная» стойка интересно и красиво, добавляя машине воздушности. Новая модель Лада Веста 2019-2020 по фото представляет, как уже говорилось новый стиль и направление в российском автомобилестроении.

А если говорить о Lada Vesta Sport, то отечественный производитель всерьёз задумался о спортивных автомобилях. Посмотрим, что из этого получится.

Интерьер

Лада Веста универсал по фото салона практически не отличается от своей версии с внедорожным обвесом, не говоря уже о моделях седан. Lada Vesta по фото выглядит красиво, достойно, приятно и вполне современно. Конечно, в плане отделки и материалов есть вопросы, но, нужно не забывать из какой ценовой категории машина. Здесь не будет дорогих пластиков, настоящих пород дерева, металла, кожи, в конце концов. Банальный жёсткий пластик, с неприятным на ощупь покрытием.

Lada Vesta Sport, как и её, менее заряженные версии получает достойный пакет оснащения. Здесь увидим современную мультимедиа, кондиционер и даже мультируль. Lada Vesta Exclusive вдобавок получает полноценную климатическую установку с понятным и продуманным интерфейсом. Причём всё это «слеплено» с хорошей эргономикой, красиво и стильно. Новая Лада Веста СВ Кросс только в базовой версии может разочаровать, ведь оснащается только обычной магнитолой, без каких-либо «наворотов».

Передние кресла, несмотря на фото, вполне комфортные, уместиться смогут седоки любого роста и комплекции, учитывая широченный выбор регулировок. Сзади только диван неудачный, хотя по размерам готов принять троих пассажиров. Дискомфорт вызывает резкий спад крыши как в СВ, так и в седан версиях. Багажный отсек радует не только правильными геометрическими формами, но и огромным по меркам сегмента объёмом.

У обеих модификаций багажник достигает 480 литров, а с учётом возможности сложить задние спинки, более 800 литров.

Комплектации и цены

Lada Vesta SW Cross выбор комплектации и цены огромен, как впрочем, и у обычных «гражданских» модификаций. Итак, подробней рассмотрим ценовую «политику» по Лада Веста 2019-2020 комплектации и цены с фото:

  • Lada Vesta Luxe обойдется в 795 000 р.
  • Lada Vesta SW Cross Exclusive заявлена по 815 000 р.
  • Лада Веста Кросс цена и комплектация Luxe Multimedia 2019-2020 оценена в 823 000 р.
  • Lada Vesta SW Cross Luxe Prestige представлена по минимальной цене в 866 000 р.

Цена Лада Веста в топовой модификации Luxe Prestige с кузовом СВ Кросс оценивается в 891 000 р. Предположительно наиболее дорогой Lada Vesta будет Sport версия. Но, пока о ней нет какой-либо достоверной информации. Как видим, самая минимальная для Lada Vesta Cross цена стартует от 795 000 р.

Лада Веста универсал от 2019-2020 года в базовом исполнении получает такой перечень оснащения:

  • Четыре подушки.
  • Противотуманки.
  • ЭРА-Глонасс.
  • Пятерка ассистентов тормозной системы.
  • Полный электропакет.
  • Подогрев передних кресел.
  • Однозонный климат.
  • Датчики света и дождя.
  • Парктроник.
  • «Музыка» с четырьмя динамиками.
  • 17 «литье».

Lada Vesta в комплектации «топ» получает дополнительно:

  • Охлаждаемый перчаточный ящик.
  • Передний парктроник.
  • Камеру заднего обзора.
  • Круиз-контроль.
  • Мультимедиа.
  • Навигацию.
  • Современную «музыку».

Комплектации Лады Весты к тому же отличаются выбором моторов. В первых двух версиях на выбор с доплатой предложены два агрегата 106 и 122 сильный. Остальные комплектации предлагаются только с топовой силовой установкой (122-сильный «бензин»).

Создан прототип битопливной версии универсала Lada Vesta, предварительная цена назначена в пределах 700 000 р. Характеристики комплектации и цены рассмотрели, теперь самое время приступать к изучению технических особенностей машины.

Кстати, многие наверняка не знали, что Cross Lada Vesta менее безопасен, чем седан модификация — обнаружились проблемы с задними лонжеронами.

Об этом подробней будет рассказано в видеообзоре.

Технические характеристики

Lada Vesta Cross технические характеристики, какая гамма силовых установок и так далее, сейчас выясним. Итак, основное, что нужно понимать, цена Лады Весты универсал формируется, в том числе в зависимости от мотора. Как известно, моторов предложено два:

  • Лада Веста 1.6 литра, генерируемая 106 л. с. и 148 Нм.
  • Lada Vesta 1.8 литра, вырабатываемые уже 122 л. с. и 170 Нм.

К примеру, Lada Vesta Exclusive предложена только с 122-сильным агрегатом. Как и у Vesta седан, двигатель сочетается с 5-ступенчатой «механикой» и 5-диапазонным «роботом». В обоих случаях только передний привод, 4*4 пока не предлагается.

Никакой информации не удалось найти о Лада Веста Спорт цены и характеристики, которой пока не объявляются. В Сети можно встретить только редкие фото машины, с характерным обвесом.

Лада Веста от 2019-2020 года, что по подвеске? Подвеска идентичная трехобъемнику, те же габариты, никаких отличий нет. В основе использовалась платформа «Лада В», с опорами спереди на базе МакФерсо, сзади классическая «балка». Рулевое управление оснащается электроусилителем, тормозная система также не обделена электронными помощниками. Спереди дисковые «блины», сзади в зависимости от версии дисковые или барабанные. В чём особенности строения Lada Vesta Sport не известно, возможно, в будущем производитель ответит на этот вопрос.

Отзывы и тест драйв

Какие отзывы реальных владельцев Лада Веста Кросс можно найти, о чём говорят владельцы, есть ли проблемы? На сегодняшний день, отзывы о Ладе Весте версии СВ или отзывы о Ладе Весте Кросс не особо отличаются. Ведь компонуются они одним и тем же силовым блоком, более того, подвеска идентичная. Соответственно, проблемы, какие и будут, то они будут похожими для обоих автомобилей.

Отзывы владельцев Лада Веста могут поведать о слабом вариаторе, все ещё есть недоверие к отечественным автоматическим коробкам, поэтому лучше отдавайте предпочтение старой доброй «механике».

А также отзывы о Лада Веста Кросс расскажут и такую особенность, что топовый мотор, по мнению владельцев практически не отличается от 106-сильного. Аналогично не тянет, да и, вообще, по моторам мнение у всех сходится, они слабоваты, тем более для Lada Vesta универсал, с большим весом, чем у седана.

Как и обещали, в конце представляем тест драйв от ведущих автоэкспертов.

Основы FRET-микроскопии | Nikon's MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 - Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специализированные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем - вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же районе, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Визуализация флуоресценции с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает из-за относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применив методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 - это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критически важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C oplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция, названный cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных N и C концов и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 - Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на протонировании нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в режиме реального времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рисунок 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, - это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 - Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 - Эффективность FRET

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R (0) - характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на Рисунок 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или буферном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 - R (0)

R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D D × Дж (λ)] 1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. рис. 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) - квантовый выход донора, Ε (A) - максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) - интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, - это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может повлиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Практически для любой реалистичной ситуации Κ (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы скорректировать это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 - Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, которые возникают из-за изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема - измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия фиксирована и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозного прохождения (также называемое перекрестными помехами и кроссовером ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (а) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие ( Рисунок 5 (b) ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, хорошо разделенных спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждая из описанных выше проблем может быть смягчена (или частично) осознанным выбором пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 - Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 - это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, рис. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, рис. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, поскольку каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, что требует четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

  • Сенсибилизированная эмиссия - Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, корректирующего перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
  • Фотообесцвечивание акцептора - Также известное как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
  • Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) - изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
  • Spectral Imaging - возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
  • Fluorescence Polarization Imaging - Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация - самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 - Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормализации этого значения к интенсивности донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, ограничивая его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание - относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-тестов сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцепторов с использованием визуализации живых клеток. На Фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET - желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фигуре , фиг.6 (d) - (f) , были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фигура 6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фигура 6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацеленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (е) ) увеличивает декхвенирование донора (усиление зеленой флуоресценции на рис. 6 (е) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET - их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 - Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеренное время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра - типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но также различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но отличные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рисунок 7 (a) - это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивности на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображения поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 - Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода - простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 - графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (a) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансный перенос энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для изучения явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке отделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета -ствол или бета -кан ), состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. Рисунок 9 ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9 ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Рисунок 9 - Архитектурные особенности флуоресцентного белка

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локальная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут давать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация в белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность - это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков с помощью хромофорной световой инактивации ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы обеспечить профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), таким образом заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние достижения в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. Таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки могут быть легко отображены в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с излучающими желтый флуоресцентными белками, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP под названием CyPet (от аббревиатуры: Cy - флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ) был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 - Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET 905 2 2

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра - суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нм и излучение при 505 нм. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом из когда-либо созданных и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой в ​​разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, еще предстоит установить пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) демонстрирует спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди всех белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 - Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (области, заштрихованные красным и синим цветом соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку цветовая палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Тем не менее, mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый свет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) со значительно увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе - это тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N - и C - с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Тандемно-димерная версия (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (вдвое больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего в красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияний, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные генно-инженерные зонды. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рисунок 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум эмиссии 635 нанометров). Несмотря на то, что яркость Катушки составляет всего две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем 650-800 нанометров, что важно для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, - это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему представляют собой наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы улучшения флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут в дальнейшем революционизировать этот новый подход к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Индия обеспокоена тем, что борцы за демократию в Мьянме пересекают границу

НЬЮ-ДЕЛИ, 10 июня (Рейтер) - Тысячи людей, спасающихся от репрессий хунты в Мьянме, перебрались в обширные восточные штаты Индии, что вызывает опасения среди местных властей по поводу того, что регион может стать плацдармом для демократических активистов и разжечь нестабильность.

Три индийских штата - Мизорам, Манипур и Нагаленд - в настоящее время приютили около 16 000 человек из Мьянмы, по оценкам групп гражданского общества и правительственных чиновников, и ожидается, что в ближайшие месяцы их число вырастет.

В Мизораме, где большинство жителей Мьянмы искали убежища, власти внимательно следят за борцами за демократию, присоединяющимися к беженцам, пересекающим неогороженную густо засаженную деревьями границу, отмеченную рекой Тиау.

«Мы очень внимательно следим за этим», - сказал Рейтер советник правительства штата.Он сказал, что некоторые боевики из Мьянмы ранее переправлялись через границу при поддержке местных жителей Индии, но с тех пор вернулись.

«Мы никогда не позволим им тренироваться в Мизораме», - сказал советник. «Если вы потревожите Мизорама, у беженцев возникнут проблемы».

В начале мая группа из не менее 50 человек из Мьянмы провела тренировочный лагерь в Мизораме, сообщил Reuters сотрудник полиции штата и член сопротивления.

В лагере в районе Чампхай города Мизорам не использовалось оружие, и он был распущен после того, как индийские военизированные формирования провели расследование, сказал член сопротивления, отказавшись назвать имя.

«Все молодые люди вернулись в Мьянму», - сказал участник сопротивления.

По меньшей мере 850 человек были убиты в беспорядках в Мьянме после того, как в феврале хунта устроила переворот, свергнув гражданское правительство во главе с лауреатом Нобелевской премии Аунг Сан Су Чжи. Одни из самых ожесточенных боев произошли в штате Чин, граничащем с Индией, в результате столкновений между военными и местными ополченцами.

Смещенный депутат из Национальной лиги за демократию Су Чжи (НЛД) сообщил агентству Рейтер, что некоторые боевики сопротивления из штата Чин закупили оружие у Индии и у Араканской армии, этнического ополчения в регионе Ракхайн в Мьянме, что способствовало подпольной торговле оружием в регионе. .

«Естественно, эти люди хотят бороться с хунтой. На мой взгляд, они попытаются закупить оружие с этой стороны (Индия)», - сказал сотрудник полиции Мизорама, знакомый с тренировочным лагерем.

«ДАЙ КИСЛОРОД»

На границе Индии с Мьянмой протяженностью 1600 километров (1000 миль) долгое время находились повстанческие группы, выступающие против правления Нью-Дели. По словам индийских силовиков, они действуют по обе стороны границы и зарабатывают на наркотиках, поступающих из Юго-Восточной Азии.

«Это искреннее беспокойство, что если повстанцы перейдут границу, это даст кислород повстанцам Нага и Манипура», - сказал Рейтер высокопоставленный правительственный источник в Нью-Дели, имея в виду около двух десятков повстанческих групп, действующих вдоль границы.

Представитель хунты Мьянмы не ответил на звонки Рейтер с просьбой прокомментировать ситуацию на границе.

Министерство иностранных дел Индии передало вопросы, касающиеся ситуации в восточном регионе, в министерство внутренних дел, которое не ответило на электронные письма и сообщения.

Авинаш Паливал, старший преподаватель международных отношений Лондонского университета SOAS, сказал, что наплыв людей и боевые действия вдоль границы с Мьянмой создали самую серьезную ситуацию с безопасностью на Дальнем Востоке Индии, часто называемом северо-востоком, за три десятилетия.

Это может повлиять на отношения Индии с хунтой и поставить под угрозу около 650 миллионов долларов из инвестиций Нью-Дели в проекты портов и автомагистралей в Мьянме. читать дальше

«Вся повестка дня в области подключения, уравновешивания Китая, наркопреступности и стратегии борьбы с повстанцами усложнилась», - сказал Паливал.

«Кризис с мигрантами на северо-востоке может в будущем принять иной, политизированный или даже милитаризованный оборот», - добавил он.

Согласно письму Рейтер от 1 июня, в котором ищут убежище около 15 000 человек из Мьянмы, власти обратились в министерство иностранных дел Индии с просьбой о помощи в создании восьми лагерей беженцев.

В соседнем Манипуре некоторые из 1000 человек, бежавших из Мьянмы, укрываются во временных лагерях в лесных районах, даже когда начинаются сильные муссонные дожди, сказал правозащитник Баблу Лойтонгбам.

Лойтонгбам и член организации студентов нагов в Мьянме заявили, что в приграничных районах этой страны разразился продовольственный кризис, в котором не хватает основных продуктов питания, таких как рис.

«Помимо насилия, там рушится экономика. Так что придет больше людей», - сказал Лойтонгбам, проживающий в Манипуре. «Люди должны найти способ выжить».

Отчетность Девджйота Гошала; Под редакцией Санджив Миглани и Раджу Гопалакришнан

Наши стандарты: принципы доверия Thomson Reuters.

Категория: Фреттинг

Лады

Zero - отличное дополнение к любой гитаре в сигарной коробке или другой сумке с инструментами, сделанной самодельным / изготовленным вручную. В этой практической статье C. B. Gitty проведет вас через нулевые лады на гитарах из коробки для сигар: что такое нулевой лад, почему вы хотите его использовать и как приступить к установке первого.

На этой фотографии изображена гитара с ладам-коробкой для сигар с установленным нулевым ладом. В этой статье мы покажем вам, как (и почему) это сделать.

Zero Fret - загадочная тема для многих производителей гитар для сигарных коробок.Должен признаться, долгое время они и для меня были загадкой. Конечно, я слышал о них, видел фотографии людей, использующих их, и думал, что понимаю большую часть концепции, но по какой-то причине я все еще уклонялся от их использования. То есть, пока Шейн Спил, наконец, не убедил мой упрямый череп, нам нужно было начать использовать их в магазине C. B. Gitty, и как только мы попробовали это, мы не оглядывались назад.

Итак, эта статья - моя попытка помочь всем осознать преимущества использования нулевого лада в своих гитарных сборках для сигар. Это может быть не для всех, но я надеюсь, что вы подумаете о том, чтобы попробовать. Я разделю эту статью на три четких раздела: что такое Zero Fret; Зачем использовать нулевой лад; и Как установить Zero Fret.

Что такое Zero Fret?

Проще говоря, нулевой лад - это дополнительный кусок лада, обычно на пару размеров больше, чем тот, который вы используете на остальной части грифа, который устанавливается в верхней части грифа, где обычно гайка. идти.

В нашей мастерской мы обычно используем никель-серебряный лад среднего / среднего размера или медный / высокий никель-серебряный лад на инструментах, которые мы создаем. Поэтому для наших нулевых ладов мы будем использовать более крупный лад, чаще всего наш стандартный никель-серебристый Jumbo. Корона джамбо-проволоки примерно на 0,014 дюйма выше, чем у Medium / Medium, и на 0,012 дюйма выше, чем у Medium / High, и мы считаем, что это помогает убедиться, что высота действия работает лучше, и минимизировать гудение в струнах. Другие конструкторы используют для нулевого лада проволоку для лада того же размера, что и для остальных ладов.Посмотрите фото ниже.

На этой фотографии показан нулевой лад и первый лад на грифе гитары с гитарной коробкой. Обратите внимание на разницу в высоте между нулевым и первым ладом, а также обратите внимание на зазор между струной и первым ладом.

На фотографии вы можете ясно видеть, что нулевой лад имеет больший профиль, чем первый лад (jumbo vs. medium), а также вы можете увидеть эффект - выраженный зазор между струнами и первым ладом. Этот зазор - это то, что технически называется «высота хода» или «высота действия» гитары, и сохранение его как можно ниже очень важно для того, чтобы иметь хорошо сделанную и удобную в использовании гитару для сигар.Как упоминалось выше, некоторые строители предпочитают использовать для нулевого лада проволоку того же размера, что и для остальной части грифа - это не то, что мы делаем, но нет никаких сомнений в том, что она может работать так же хорошо. Мы советуем попробовать оба варианта и посмотреть, что работает для вас!

Другие вещи, которые вы можете увидеть на фотографии выше, - это маленькие винты, которые используются в качестве фиксаторов струн, чтобы гарантировать, что струны остаются в нужных местах и ​​под хорошим углом, когда они пересекают нулевой лад. Подробнее об этом ниже.

Зачем нужен нулевой лад?

Как упоминалось выше, чтобы создать гитару с ладами в виде коробки для сигар, на которой профессиональный музыкант захочет играть, вы должны уделять очень пристальное внимание «высоте действия», то есть высоте струн над ладом. Вы хотите, чтобы он был как можно ниже, но не настолько низким, чтобы при игре струны гудели или дребезжали.

На этой фотографии показан пример использования стандартной костяной гайки на четырехструнной гитаре для сигар.

Традиционно определение высоты рабочего хода на гитаре выполняется гайкой. Чаще всего гайки на гитарах, покупаемых в магазине, делают из кости, но они также могут быть сделаны из пластика, дерева, металла или синтетических материалов, например кориана.

Гайка приклеивается на место в верхней части грифа и отпиливается / шлифуется до нужной высоты, а затем проделываются канавки для струн, чтобы помочь удерживать струны в правильном положении. Таким образом, гайка устанавливает высоту действия (высоту струн над ладом), а также расстояние и положение струн на грифе.

Проблема с гайкой в ​​том, что требуется определенное мастерство и тонкость, чтобы придать им правильную форму и нужную высоту, а также канавки для струн именно так. Конечно, если вы запилите его слишком глубоко, пути назад не будет - вам придется удалить его и начать заново с нового. Слишком легко получить инструмент с высоким действием, на котором не очень весело играть, и он может даже плохо интонировать при использовании орехов.

Enter the Zero Fret - когда вы используете нулевой лад, вам практически гарантировано, что ваша высота действия будет в значительной степени идеальной. Хорошее практическое правило, касающееся высоты рабочего рычага на гитаре, заключается в том, что зазор между струнами и первым ладом должен составлять около 0,80 мм, что просто соответствует толщине стандартного медиатора гитары среднего размера. Если вы используете джамбо или даже один из высокопрофильных средних калибров в качестве нулевого лада и одну из стандартных струн средней высоты (высота короны от 0,040 ″ до 0,045 ″) в качестве остальных ладов, вы определенно будете в этом районе.

Вот еще один угол нулевого лада, установленного на гитаре из сигарного ящика.Эта конкретная гитара имела наклонную головку грифа, поэтому фиксирующие винты просто удерживают струны в правильном положении, а не удерживают их, чтобы увеличить угол обрыва.

Одно предостережение относительно нулевого лада заключается в том, что вам все же необходимо установить какое-то оборудование, которое поможет удерживать струны на месте. В зависимости от конструкции вашей грифа (наклонные куплеты утоплены), это оборудование может также служить для удержания струн вниз, чтобы у них был некоторый «угол разрыва» при движении вверх и через нулевой лад.На фото ниже показано, каков угол разрыва.

Существуют различные стили фиксаторов струн, которые можно использовать для этого, но на гитарах C. B. Gitty в коробке для сигар мы обычно используем для этой цели маленькие винты с круглой головкой (как показано на фотографиях выше и справа).

Как установить свой первый Zero Fret

Предполагая, что вы прочитали все вышесказанное, не должно остаться слишком много загадок относительно того, как вы должны установить свой первый нулевой лад на гитаре с сигарной коробкой.Вот план следующих шагов:

  • Купите себе проволоку для лада большего размера, например, наш профиль Jumbo.
  • При прорезании прорезей для ладов прорежьте прорезь точно по линии гайки (обычно вы не режете ее, когда используете гайку). Прорезь можно распилить той же пилой, что и остальные.
  • Вставьте один кусок проволоки большего размера в прорезь, которую вы прорежете на линии гайки, и используйте меньшую проволоку для остальных ладов.
  • Сгладьте и обработайте лады, как обычно, включая нулевой лад большего размера.
  • Когда вы дойдете до того, как натянуть гитару, выясните, куда пойдут ваши струны и где должны быть размещены держатели струн / винты. Посмотрите фотографии выше, чтобы понять, где мы размещаем их на 3-струнной гитаре. Помните, что вы хотите, чтобы фиксатор удерживал струну в правильном положении по отношению к грифу, а также (при необходимости) помогал немного прижимать струну, чтобы она снова наклонялась вверх, чтобы пересечь нулевой лад.
  • Фотография ниже помогает показать, как крепежные винты можно использовать на гитаре с коробкой для сигар, которая имеет утопленную (а не наклонную) головку грифа.Винты фактически тянут струны вниз от того места, где они выходят из стоек тюнера, так что они подходят к гайке (или нулевому ладу) под более острым углом. На этой фотографии показана гитара без натяжения с гайкой стержня с резьбой, но принцип тот же самый, когда используется нулевой лад. Этот более острый угол помогает гитаре звучать и лучше интонировать (слишком низкий угол, и струны могут гудеть или вибрировать).
На этой фотографии показано, как можно использовать крепежные винты для регулировки «угла разрыва» струн - угла, под которым они пересекают гайку / нулевой лад.Хотя на этой фотографии изображена гитара в коробке для сигар без протяжки, в которой используется гайка стержня с резьбой, та же концепция применима к гитаре с нулевым ладом.

Теперь вы можете натягивать струны и настраивать свою гитару, а нулевой лад должен давать вам оптимальную высоту действия. Дополнительный шаг, связанный с использованием фиксаторов струны, - небольшая цена по сравнению с хлопотами, связанными с установкой и опиливанием гайки и получением ее в самый раз.

Нулевые лады при правильном использовании всегда гарантируют хорошую высоту струны, по крайней мере, в C.B. Магазины Gitty, на которые мы перешли, почти все наши гитары в коробках для сигар Farmington Road Instrument Works.

Я надеюсь, что эта статья поможет вам лучше понять, что такое нулевой лад, почему вы хотите их использовать и как это сделать. Не стесняйтесь оставлять комментарии или отправлять вопросы, чтобы я мог исправлять, расширять и дополнять эту статью!

Интернет-кампус ZEISS Microscopy | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Сложная ассоциация между белками и путями передачи сигналов, которые контролируют клеточную функцию, зависят от множества слабых и временных динамических взаимодействий, которые часто трудно или даже невозможно охарактеризовать с помощью традиционной биохимической методологии.Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала превосходную чувствительность при обнаружении чрезвычайно низких концентраций меченых биомолекул в очень широких пространственных и временных измерениях. С появлением и разработкой высокоэффективных генетически кодируемых флуоресцентных белков, которые могут стабильно экспрессироваться в живых клетках, несколько методов флуоресценции стали мощными инструментами для визуализации динамических взаимодействий между белками in situ в физиологических условиях. В частности, применение резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) становится все более популярным, чтобы служить в качестве молекулярной линейки при определении межмолекулярных расстояний или для демонстрации того, образуются ли даже молекулярные комплексы.Для конструирования биомолекул, потенциально способных к взаимодействию FRET, можно использовать простые методы молекулярной биологии для слияния кДНК, кодирующей флуоресцентные белки, с белками-мишенями, которые, как предполагается, участвуют. В настоящее время предпочтительными флуоресцентными белками для анализа FRET являются производные GFP медузы Aequorea victoria с голубой и желтой эмиссией (ECFP и EYFP) в качестве доноров и рецепторов соответственно. Хотя ECFP и EYFP использовались в многочисленных исследованиях FRET, несколько новых и более совершенных вариантов, Cerulean (производное голубого) и Citrine или Venus (желтые производные), оказались очень эффективными в обеспечении расширенного динамического диапазона, необходимого для внимательно следите за чувствительными сигналами FRET.Кроме того, постоянное расширение цветовой палитры флуоресцентных белков предоставляет новых кандидатов в оранжевой, красной и дальней красной области спектра в качестве потенциальных партнеров FRET для существующих голубых, зеленых и желтых белков.

Среди наиболее полезных применений FRET в клеточной биологии - метод, который включает слияние двух флуоресцентных белков с концами экологически чувствительного белка или пептида, чтобы действовать как биосенсор определенных клеточных функций.Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение в сообщении о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков, способных к FRET, с биополимерами, которые выполняют важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые полезны для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как кальциевая волна. индукция, эффекты передачи циклических нуклеотидов, pH, флуктуации мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 1). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков (в данном случае Cerulean и Venus), связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, датчик демонстрирует очень сильный резонансный перенос энергии, который полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности. Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами.Принципы резонансной передачи энергии Ферстера (FRET)

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Максимумы (пики) спектральных профилей возбуждения и излучения отделены друг от друга переменной шириной полосы в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Маркировка внутриклеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специализированные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, оказываются совпадающими (и говорят, что они колокализуются). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна.В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. FRET - это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии (донор ) ко второму флуорофору (акцептор ) в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения FRET могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий.

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который способен передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения флуорофора в возбужденном состоянии как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии (которая не происходит в FRET) требует испускания и последующего повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. . В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, - это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции (от которой экспериментальная эффективность FRET можно извлечь).Если акцептор является флуоресцентным, он будет излучать фотоны в соответствии со своим характерным спектральным профилем, производя, таким образом, измеримое ратиометрическое изменение сигнала. Большое отношение интенсивности акцептора к донору указывает на высокую эффективность FRET, которая также может быть приписана более короткому расстоянию или более благоприятной ориентации между флуорофорами. Эффективность процесса передачи энергии ( E FRET ) изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора ( r ), как показано в уравнении, представленном ниже.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорофором, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга. Таким образом, эффективность FRET математически можно описать как:

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R 0 (обычно называемый радиусом Ферстера) представляет собой характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов.В дополнение к требованию близости, эффективная передача энергии требует значительного перекрытия спектров излучения донора и спектров поглощения акцептора (как показано на рисунке 2). Эффективность повышается за счет увеличения квантового выхода донора и / или коэффициента экстинкции акцептора. Например, квантовый выход ECFP составляет 0,40, тогда как квантовый выход Cerulean примерно на 50 процентов больше, что увеличивает эффективность FRET, когда Cerulean заменяется на ECFP в качестве донора FRET.Точно так же коэффициент экстинкции Венеры примерно на 11 процентов выше, чем у EYFP, что делает Венеру лучшим акцептором FRET. В общем, спектральное перекрытие между донором и акцептором должно быть достаточным для обеспечения радиуса Ферстера, который составляет приблизительно 4 нанометра или более. Другим важным параметром, который следует учитывать при выборе флуоресцентных белков в качестве пар FRET, является соответствие относительной скорости созревания. Время, необходимое для созревания хромофора, колеблется от нескольких минут до многих часов, в зависимости от конкретного белка, и может широко варьироваться в пределах других близкородственных вариантов.Измерения FRET будут скомпрометированы в случаях, когда донорский флуоресцентный белок созревает значительно быстрее или медленнее, чем акцептор.

Для оптимизации измерений FRET необходимо учитывать множество других факторов. Одна из основных проблем - относительная яркость донорных и акцепторных флуорофоров. Как правило, из-за ограниченного динамического диапазона большинства микроскопов сопоставимые по яркости флуорофоры дают более удовлетворительные результаты. Значительное несоответствие яркости часто приводит к тому, что сигнал от одного флуорофора насыщает канал детектора, а сигнал от другого (диммера) флуорофора теряется в минимальном уровне шума.Другой часто встречающейся ловушкой является прямое возбуждение акцептора на длине волны, используемой для возбуждения донора, что приводит к избыточной эмиссии акцептора, которая не возникает в результате FRET. Этот артефакт упоминается как акцепторное спектральное просачивание . Кроме того, флуоресцентное излучение от донора может просачиваться в канал обнаружения акцептора (известный как донорское спектральное просачивание ), что также приводит к искусственно завышенным значениям FRET (рис. 2). В связи с тем, что эти источники проступания будут присутствовать практически во всех парах FRET, они неизбежно должны быть устранены во время измерений FRET.Флуоресцентные белки в анализе FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, которые идеально подходят для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки. Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне плазматической мембраны, но эти зонды не могут проникнуть через мембрану и поэтому мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии, комплекс Гольджи. , или эндоплазматический ретикулум.Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время являются одними из лучших кандидатов на флуорофоры для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением. Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от ширины полосы 30-40 нм при полной ширине на полувысоте ( FWHM ), характерной для спектральных профилей излучения многих синтетических красителей, во флуоресцентных белках они колеблются от примерно 60 до более 100 нанометров, что часто приводит к значительные области перекрытия при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора.Таким образом, широкие спектральные профили флуоресцентных белков ограничивают количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220-230 аминокислот, свернутый в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета--ствол; см. Рисунок 3) и состоящий из сильно связанных водородными связями бета -листы, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую остатки, образующие хромофор.Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов, воды и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно заполнена боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET (рис. 3). Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентных белков пептидными остатками (на ограничивающем расстоянии близкого приближения от 2 до 3 нанометров), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET, которую можно получить с флуоресцентными белками, примерно до 40 процентов от теоретическое значение.Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Проблемы, связанные со спектральной шириной полосы и размером, с которыми сталкиваются флуоресцентные белки, также связаны с их высоким сродством к олигомеризации. Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют по крайней мере ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных димеризоваться при иммобилизации в высоких концентрациях (например, когда связаны с плазматической мембраной).Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (таких как актин, тубулин и щелевые соединения; см. Рисунок 4). Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание, при условии, что локализованная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локальная концентрация белка может стать достаточно высокой, чтобы позволить димеризацию.Это явление может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые часто дают сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков медуз в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Клеточный дистресс, ведущий к апоптозу или некрозу, - это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков.Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое происходит при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров, светодиодов и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп. В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы склонны реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку.Флуоресцентные белки обычно не фототоксичны для клеток, отчасти из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки (см. Рисунок 3). При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.К сожалению, низкие коэффициенты поглощения и квантовые выходы мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков препятствуют их широкому применению в анализе FRET. Возможно, по мере открытия новых вариантов флуоресцентных белков зонды в более длинноволновых цветных областях станут полезными акцепторами FRET для желтых и зеленых доноров.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET и не мешают другим важным биологическим явлениям.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки рифовых кораллов (обсуждаемые выше) имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков посредством хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed, способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности ECFP и EYFP показали, что даже через хромофоры, способные генерировать синглетный кислород, эти зонды неэффективны в качестве фотосенсибилизаторов. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих любой вариант EGFP, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным показателем возможности фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной покадровой визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, вращающегося диска, многофотонного и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. газоразрядная лампа против лазерной системы. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Первой парой флуоресцентных белков, разработанной для анализа FRET, был синий вариант (EBFP) в сочетании с EGFP, предназначенный для возбуждения источником ультрафиолетового света. К сожалению, относительно плохие фотофизические свойства EBFP, наряду с потенциальной фототоксичностью коротковолнового освещения, сделали эту комбинацию непрактичной. Новые варианты синего флуоресцентного белка могут воскресить эту стратегию спаривания для краткосрочных наблюдений, но им все равно будет мешать потребность в высокоэнергетическом возбуждении, что исключает использование голубых флуоресцентных белков для долгосрочной визуализации.Наиболее эффективной парой флуоресцентных белков FRET остается высокоэффективный вариант ECFP в качестве донора, связанный с высокоэффективным вариантом EYFP в качестве акцептора. Другие пары включают EGFP или производное EYFP в качестве донора для оранжевых и красных вариантов, таких как мономерный Kusabira Orange или mCherry. Среди проблем, связанных с применением оранжевых и красных флуоресцентных белков (все они получены из рифовых кораллов и морских анемонов) в качестве акцепторов FRET, являются длинные хвосты возбуждения, представленные в спектральных профилях поглощения.Во многих случаях спектры поглощения простираются в голубую и зеленую области спектра, что приводит к прямым артефактам возбуждения акцепторов.

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Белковая пара Максимум возбуждения донора
(нм)
Максимум излучения акцептора
(нм)
Квантовый выход донора Коэффициент молярной экстинкции акцептора Яркость акцептора
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57,500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83,400 4,9 1: 4 9040u 528 0,62 92,200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51,600 492 528 0.85 92,200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5,1 1: 4,5 610 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
Venus-mCherry 528 610 0,57 72,000 528 581 0.57 138,000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41,000 5,2 13: 1 13: 1
Флуоресцентный
Белок
Пара
Донор
Возбуждение
Максимум
(нм)
Приемник
Эмиссия
Максимум
(нм)
Донор
Quantum
Выход
Акцептор
Коэффициент экстинкции
Förster
Расстояние
(морских миль)
Яркость
Коэффициент
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57 500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83 400 4,9 1: 4
Церулеанско-Венера 440 528 0.62 92 200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51 600 5,3 1: 2
TFP1-m Вена 492 528 0.85 92 200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5,1 1: 4.5
EGFP-mCherry 507 510 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
Венера-mCherry 528 610 0,57 72,000 5,7 3: 1
Венера-tdTomato 528 581 0.57 138 000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41 000 5,2 13: 1
Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с усложнением конструкции химерных белков (слитые и биосенсоры), привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые являются потенциально полезно в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единую генетически закодированную конструкцию, как кратко обсуждалось выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках.Методы измерения FRET

В связи с тем, что практически все комбинации флуорофоров, используемые для мониторинга FRET, сталкиваются с различными и часто уникальными проблемами, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя критически важно полностью понять методологию, в соответствии с которой FRET используется. измеряется. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После того, как система была настроена, а результаты согласованы и хорошо поняты, простейшие экспериментальные подходы могут быть использованы для дополнительных измерений. Несмотря на то, что было разработано большое количество методов для измерения FRET, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве центров микроскопии керна. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничиваются несколькими методами, которые будут рассмотрены ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просвечивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. И донор, и акцептор обычно вносят свой вклад в просачивание, которое может быть обнаружено в канале FRET. Просачивание от донора происходит из-за перекрытия профилей излучения флуоресценции донора и акцептора, которые часто очень широкие (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, просачивание из акцептора происходит в результате прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и образования FRET.Большое количество других источников шума также может испортить измеряемый сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также вариации спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

«утечки сигнала» можно в значительной степени избежать, используя методы FRET, такие как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое , понижающее гашение донора ; см. Рисунок 5) и микроскопию визуализации времени жизни флуоресценции ( FLIM ), но эти методы также могут вводить другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины подавленного донорного сигнала (рис. 5 (а)) в присутствии акцептора с последующим измерением ослабленного донорного сигнала после того, как флуоресценция акцептора была разрушена посредством фотообесцвечивание (рис. 5 (б) и 5 ​​(в)). Основная концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора тушится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если FRET происходит между донором и акцептором, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ фотообесцвечивания акцепторов является то, что каждая исследуемая клетка служит своим собственным контролем, что делает этот метод одним из самых точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора заключается в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (по крайней мере) примерно до 10 процентов от его исходного значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор необратимо фотообесцвечивается (фактически разрушается), методика фотообесцвечивания акцептора не может быть повторена на одной и той же ячейке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, которую демонстрируют многие флуоресцентные белки, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть скомпрометированы, если вся ячейка не будет отбелена за один этап.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы позволяет притоку свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора по-прежнему широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает отличный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни донорной флуоресценции в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто встречающихся при методах фотообесцвечивания акцепторов.FLIM, пожалуй, самый строгий метод, используемый для измерения FRET, и он менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание их флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундной шкале времени. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, влияющим на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут гасить флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни донорной флуоресценции, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически, флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого гашения может быть определена путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Комбинация FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другую методологию, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами не являются флуоресцентными.Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом для получения изображений FRET. Главное соображение заключается в том, что наносекундные измерения срока службы чрезвычайно сложны и должны проводиться с использованием дорогостоящих приборов, которые не широко доступны. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что сильно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одно осложнение - это многоэкспоненциальные кривые спада времени жизни, которые обычно встречаются у многих флуорофоров, которые обычно требуют более всеобъемлющих стратегий сбора данных и усложняют анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, изменения pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов акцепторного фотообесцвечивания и FLIM, однако они представляют собой важные средства контроля для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый простой и простой метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (в литературе обычно называется двухцветным ратиометрическое изображение ; см. Рисунок 6), который может быть выполнен на стандартном широкоугольном микроскопе, оборудованном соответствующей флуоресценцией. наборы фильтров.При сенсибилизированной эмиссии донорный флуорофор возбуждается определенной полосой длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных на флуоресценцию донора или акцептора. Этот метод может дать результаты очень быстро (ограниченный только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В том маловероятном случае, когда не происходит просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров, сенсибилизированное излучение будет преобладающим методом измерения FRET.К сожалению, просачивание обычно является значительной проблемой, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы вычесть проступание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рисунке 6 представлена ​​серия изображений, полученных при широкоугольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, пересекающих цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный вектор камелеона YC3.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые содержат белок кальмодулин и кальций-кальмодулин-связывающий домен киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в линейной химере. В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рисунке 6 (а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индукции связывания кальция с биосенсором.На рисунках с 6 (b) по 6 (h) показаны изображения в псевдоцветном соотношении кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волной цитоплазмы в этих клетках составляло приблизительно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Для сенсибилизированного излучения был описан ряд корректирующих подходов с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор или образец FRET как с донором, так и с акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и излучения и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в окончательном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействие между донором и акцептором является слабым.Спектральная визуализация в измерениях FRET

В приложениях FRET построение спектральных изображений можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения как донорной, так и акцепторной флуоресценции вместо сбора данных по двум независимым каналам. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, методика в основном ограничивалась спектроскопическими экспериментами с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с различными формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с использованием фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. Рисунок 7 (a)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора и на основе этой информации (в сочетании с контролями) вычислить эффективность FRET.

На фиг. 7 представлено логометрическое измерение спектрального изображения для флуоресцентного белкового биосенсора кальция, известного как cameleon YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7 (а)) и отсутствии (желтая кривая) кальция демонстрируют высокий динамический диапазон зонда при 530 нанометрах. Рисунки биосенсора Cameleon представлены в присутствии (Рисунок 7 (b)) и в отсутствие (Рисунок 7 (c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13, чтобы переместить две флуоресцентные белковые части ближе друг к другу. .Лямбда-стек изображений с 10-нанометровыми интервалами клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7 (d). Обратите внимание, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нанометров.

Сравнение спектрального изображения с линейным несмешиванием и сенсибилизированного излучения с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал / шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем у спектрального изображения (хотя это не всегда так и зависит от сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для отделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство используемых фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отказ от большого количества выбросов приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральная визуализация обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто отбрасываемых произвольно).Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня просачивания из-за прямого возбуждения акцептора, но метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оснащены.

Конфокальные микроскопы

для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими перестраиваемыми фильтрами ( AOTF, ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных ограниченных диапазонах длин волн для генерации так называемых лямбда-сумм (изображения боковых ( x, y ) как функция длины волны).Спектральные сигнатуры ( эмиссионных отпечатка ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как автофлуоресценция) получают в результате деконволюции стэков лямбда. Метод линейного разделения может быть применен к лямбда-сумме для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждый пиксель полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием может определять и устранять вклад просачивания донора в сигнал FRET.Однако из-за того факта, что флуоресцентное излучение, вызванное прямым возбуждением акцептора (называемое просачиванием акцептора, см. Выше), идентично по спектральным характеристикам сигналу флуоресценции, производимому FRET, необходимо разработать элементы управления, которые помогают определить и устранить вклад акцепторного просачивания, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в флуоресцентных белковых биосенсорах без использования контроля.Последняя стратегия, пожалуй, наиболее широко применяемый метод исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения просвечивающего излучения акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях FRET для получения спектральных изображений большинство подходов основано на предположении, что при отображении в идентичных условиях динамика этих артефактов будет по существу одинаковой в контрольных ячейках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор).Однако из-за того, что разные ячейки используются для определения вклада проступания в экспериментальных ячейках, отдельные местоположения пикселей нельзя сравнивать напрямую. В большинстве случаев можно сравнить пиксели как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют совпадающие уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень проступания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения проступания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных ячейках, которые выражают как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые сконструированы с вариантами голубого и желтого флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), для получения спектрального изображения требуется возбуждение голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. В современных конфокальных микроскопах используются диодные и газовые лазеры со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако спектральная линия длиной 458 нм от аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, диодные лазеры с длиной волны 405 и 440 нм будут генерировать меньше проступания (примерно 4 и 8 процентов, соответственно), но загрязняющий сигнал от прямого акцепторного возбуждения все равно должен быть удален для точного расчета сигнала FRET. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I DA ) и отсутствии ( I D ) акцептора эффективность FRET может быть определена с помощью следующего соотношения:

E FRET = 1 - (I DA / I D )

Расчет эффективности FRET таким способом был подтвержден с использованием пар флуоресцентных белков FRET, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также гораздо более сложной задачи исследования FRET между зондами, которые экспрессируются отдельно.Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией, основанной на интенсивности, и методологией FLIM. Однако спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что является обычным явлением для сенсибилизированного излучения на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. Следует обратить внимание на то, что компонент спектрального просвечивания акцептора часто является незначительным и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов с фотоумножителями, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определив просачивание на разных уровнях интенсивности в контрольных ячейках.

Перекрестного возбуждения акцептора можно избежать, выбирая пары FRET флуоресцентного белка, у которых есть донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine являются производными GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (приблизительно 400 нанометров), но излучают либо в зеленой (510 нанометров), либо в желтой (530 нанометров) областях спектра.Когда эти доноры сочетаются с оранжевыми или красными флуоресцентными акцепторами белка, возбуждение пары FRET вызывает скудное просачивание акцептора и не требует никаких поправочных факторов или контролей. Например, соединение производной GFP, известной как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которая может быть возбуждена с помощью 405-нанометрового диодного лазера и успешно наблюдаться с помощью спектральной визуализации. Поскольку GFP2 и EYFP имеют сильно перекрывающиеся спектры излучения, линейное разделение данных FRET позволяет определить вклад каждого флуорофора в общее излучение флуоресценции.Аналогичным образом, связывание мАметрина с тандемно-димерным томатом (tdTomato) дает пару FRET, которая излучает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на 405 нм. Возбуждение только tdTomato на этой длине волны практически не дает детектируемого сигнала, поэтому при использовании этой пары поправка на просачивание акцептора не требуется. Подобные пары FRET, вероятно, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различать эмиссионный сигнал акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора в флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральная визуализация с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (почки кролика) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение выраженного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а), а изображения эмиссии mCerulean и mVenus с разрешенным спектром показаны на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно.После фотообесцвечивания mVenus в ячейке, показанной в нижней части окна светом 514 нанометров (Рисунок 8 (f)), флуоресцентное излучение mCerulean увеличивается (Рисунки 8 (d) и 8 (e)) как следствие донорства. обезвоживание.

Фотообесцвечивание акцептора обычно достигается с помощью лазерной спектральной линии, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET для фотообесцвечивания EYFP обычно используется 514-нанометровая аргонно-ионная лазерная линия, тем самым уменьшая гашение ECFP с последующим увеличением донорного сигнала (рисунки 8 (d) -8 (f)).Поскольку EFYP постепенно фотообесцвечивается, лямбда-сканирование спектрального изображения проводится с использованием линии аргон-ионного лазера длиной 548 нанометров (возбуждающий ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания для регистрации изменений спектрального отклика. Как правило, лямбда-пакеты собираются в диапазоне длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретных полосах пропускания (приблизительно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход разработан для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP можно затем экстраполировать из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается фотообесцвечиванию полностью. Конечная цель - избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор является фотостабильным, а акцептор - фотолабильным. Эту ситуацию можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с использованием метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый шаг состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности доноров ECFP и акцепторов EYFP следует расчет изменений интенсивностей для определения эффективности FRET. После получения стопок лямбда используется линейное размешивание для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стопок.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов, которые демонстрируют хорошее отношение сигнал / шум, и использования эталонных спектров, которые точно представляют спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для генерации эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием приведенного выше уравнения, где ( I DA ) и ( I D ) представляют собой нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. В связи с тем, что EYFP почти никогда не обесцвечивается полностью, значение для ( I D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение выбросов ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Технику фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (такими как EGFP и mKusabira Orange) аналогичным образом.

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации получил название lambda FRET и оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорные и акцепторные компоненты для получения пиксельного расчета эффективности FRET.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просвечивания, основанную на получении эталонных отраженных изображений, и была подтверждена с использованием синтетических флуорофорных стандартов FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияния флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с переменной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании отраженных изображений для нормализации для различной интенсивности излучения, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда FRET полезна в случаях, когда высокое спектральное перекрытие и артефакты автофлуоресценции присутствуют как в сценариях визуализации фиксированных, так и живых клеток.

Помимо исследования межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцепторов и коррекции просвечивания, спектральная визуализация была очень полезной для исследования флуоресцентных белковых биосенсоров для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается или устраняется FRET, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, творчески объединив пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для визуализации важных оптических живых клеток. метаболические и сигнальные процессы.Обычно два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый варианты) вставляются на противоположных концах сенсорного белка или пептидной последовательности (см. Фиг. 9), как кратко описано выше. Изменения в конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, в уровне FRET, который может наблюдаться между фланкирующими флуоресцентными белками. Ратиометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена ​​карикатура, иллюстрирующая общие стратегии построения флуоресцентных белковых биосенсоров. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют собой YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны - на флуоресцентное излучение (на 475 нм, голубой; или 530 нм, желтый). Сенсорные домены имеют телесный цвет, а эффекторные агенты - сферы или эллипсы. На рисунке 9 (a) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, а на рисунке 9 (b) изображен флуоресцентный белковый биосенсор с одним сенсорным доменом и эффекторным лигандом.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рисунке 9 (a) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рисунке 9 (b) вызывает конформационные изменения в сенсорном домене, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для передачи энергии (см. Также Рисунки 7 (б) и 7 (в)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рисунок 9 (c)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рисунке 9 (a). Флуоресцентный белковый биосенсор, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)), работает путем устранения FRET после того, как соответствующая протеаза была индуцирована.Биосенсоры протеазного расщепления являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в некоторых биосенсорах FRET, использующих производные голубого и желтого цветов, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений, широкой доступности и простоты сравнения с другими датчиками, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, включая голубые и бирюзовые донорные флуоресцентные белки, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также зеленые флуоресцентные доноры белков, связанные с красными флуоресцентными белками-акцепторами. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и морских анемонов, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сопоставляют сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера длинного стоксова сдвига, как обсуждалось выше.Без сомнения, появятся усовершенствованные биосенсоры с использованием более точно настроенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием будет по-прежнему рассматривать увеличение нагрузки как один из методов выбора для анализа FRET.

Выводы

Был разработан ряд методов для анализа FRET флуоресцентных белков, а также синтетических красителей и квантовых точек.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным несмешиванием обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, что обычно встречается с образцами FRET. Новые флуоресцентные белковые биосенсоры обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего совершенствования аналитических методов спектральную визуализацию можно комбинировать с методами фотообесцвечивания на протяжении всего срока службы или акцептора.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в пределах области спектральной визуализации, но гораздо труднее выполнять с использованием традиционной методологии.

Фретти Кросс

Фретти Кросс

Переплетенный крест в геральдике известен как Fretty Cross (фр. Frettée ). С несколько более плотным переплетением он будет называться Trellised Cross .

Крест, конечно, не ограничивается геральдикой, и ниже мы рассмотрим рисунок в христианском контексте.

«Лада» имеет несколько значений, все из которых происходят от древнеанглийского freten : съесть, потреблять. Беспокоиться о чем-то - значит беспокоиться или раздражаться из-за чего-то, что съело наше терпение или удовлетворенность.

Когда океанские волны разбиваются о скалы, это раздражение более известно как «эрозия». Плавно текущие реки или медленно движущиеся ледники прорывают новые каналы в скалах. Точно так же ветер и дождь в конечном итоге раздражают даже самые твердые камни.(Хард-рок? Да, я скоро расскажу вам кое-что о рок-н-ролле.)

В искусственной резьбе такие материалы, как дерево или металл, обрезаются, образуя замысловатые узоры, некоторые из которых могут создавать вид перекрывающихся или переплетенных полос, как мы видим на кресте Фретте.

Этот симметричный рисунок легко копировать и, следовательно, является популярным декоративным узором, особенно в геральдике. Он появляется, например, на гербе семьи Харрингтон в Саффолке и Эссексе, что приводит к альтернативному названию: Узел Харрингтона .Это также главная особенность флага Коцелева в Сербии.

Перекрывающийся характер рисунка означает, что некоторые линии являются или кажутся выпуклыми (рельефными), и поэтому выступающие гребни, расположенные на грифе гитары, называются ладами. Гитарные лады могут изнашиваться после многих лет использования, особенно когда в хэви-метал-роке используются такие техники, как лад правой рукой. Но запасные лады достаточно дешевы, так что не нужно беспокоиться о том, что лады будут раздражать.

Так же, как скрученная веревка прочнее прямых отдельных прядей, переплетенный материал добавляет прочности.Парадоксально, но структура, построенная вокруг истощения (раздражения), ведет к чему-то более сильному.

Эту аномалию также можно найти в Библии: когда Иисус был распят на кресте, преследователи намеревались уничтожить нежеланного пророка. Но вместо этого Распятие произвело противоположный эффект. См. Значение креста.


Фото
Мэй Брит Лиза - Дания

На фотографии справа, любезно присланной нам Мэй Брит Лиза из Дании, изображен серебряный кулон с двенадцатью переплетающимися полосами.

Это напоминает нам не только о повелении Христа своим двенадцати ученикам распространять Евангелие, но и о hipostatis, что Бог - это три Божественные Личности, связанные вместе как Одно, и что мы также можем быть связаны любовью к Богу.

Запоминание грифа. Несколько мнемоник для быстрого изучения заметок… | Андрей Лушников

Шаг 1. 12 нот

Прежде чем делать что-либо еще, выучите наизусть только эти 12 нот:

  • Запомните стандартный строй: E-A-D-G-B-E.Настройка определяет ноты на открытых струнах. Они не только всегда пригодятся, но и являются нотами на 12-м ладу , так что вы выучите вдвое больше с меньшими усилиями!
  • Запомните естественные ноты 6-й струны . Они пригодятся при игре аккордов барре, и это также ноты 1-й струны ! Опять вдвое больше прибыли!
12 суперполезных нот

Шаг 2. Группирование

Давайте подробнее рассмотрим естественные ноты.Всего их 7: C-D-E-F-G-A-B. Объединим их в две группы:

  • CDE-group. В этой группе есть три естественных ноты - C, D и E. Я произносю это как « sidii », что напоминает 💿 и создает хорошую мнемонику.
  • ФГАБ-группа. В этой группе есть ноты F, G, A и B, которые являются всеми другими естественными нотами.

Обратите внимание, что между любыми двумя последовательными нотами внутри любой группы расстояние всегда составляет полный тон (а - ровно два лада на гитаре).Например, это полный тон между C - D и G - A. Однако для пересечения границы между группами требуется только полтона (а ровно один лад на гитаре): интервалы E —F и B — C составляют только полтона.

CDE-группа и FGAB-группа

Теперь вместо запоминания позиций отдельных нот мы будем запоминать позиции CDE-группы и FGAB-группы.

Шаг 3. Группа FGAB

самая большая из двух групп, группа FGAB, расположена в самом центре грифа гитары, прямо под четырьмя точками, помеченными на ладу.Посмотрите на картинку ниже, и вы больше никогда не забудете, где группа FGAB находится на грифе!

FGAB-группа в самом центре гитары

Шаг 4. CDE-группы

Так что FGAB-группу было легко обнаружить. А как насчет CDE-group? Оказывается, группа CDE визуально хорошо сочетается с группой FGAB, создавая красивую симметричную структуру , которая напоминает « лестницу »:

Группа FGAB, разделенная на две группы CDE

Эти 10 заметок уже дают достойное покрытие грифа.Однако было бы неплохо иметь что-нибудь на второй струне.

Как вы помните, 2-я строка - это исключение , поскольку это единственная строка с нерегулярной настройкой. Поэтому группа CDE на 2-й струне начинается на 1-м ладу, что тоже легко запомнить.

CDE-группа на 2-й струне

Как читать аккордовую диаграмму и другие обозначения аккордов

Последнее обновление 14 мая 2019 г., автор: Klaus Crow

Bigstock photo

Первое, что вы хотите сделать, когда начинаете играть на гитаре, - это научиться читать схему аккордов (и купить гитару).

Умение читать схему аккордов или другие типы обозначений аккордов очень важно, когда вы хотите изучать поп, рок, блюз или любой другой стиль музыки.

Когда вы пойдете и купите гитарную книгу, в большинстве книг будут показаны схемы аккордов для соответствующей песни, но вы также найдете их в Интернете, в программах для нотной записи и приложениях.

Вначале вам нужно будет только выучить небольшой словарный запас аккордов, чтобы вы могли сыграть много песен. Так что давай покатим этого ребенка!

Существуют разные типы аккордовой записи.Начнем с самого традиционного и точного.

Аккордовая диаграмма

Схема аккордов представляет гриф гитары (см. Изображение ниже).
Шесть вертикальных линий представляют шесть струн на гитаре. Слева направо; нижняя строка E, строка A, строка D, строка G, строка B и высокая строка E или также называемые: 6-я, 5-я, 4-я, 3-я, 2-я и 1-я строка.

Горизонтальная верхняя линия (которая толще нижних горизонтальных линий) указывает на гайку гитары.Вторая горизонтальная линия - это 1-й лад, за которым следуют 2-й, 3-й, 4-й и 5-й лад.

Черные точки показывают, где нажимать на струну пальцами левой руки.

Цифры на точках указывают, какой палец использовать.


1 = указательный палец

2 = средний палец

3 = безымянный палец

4 = мизинец

Символы «x» и «o» над гитарным гайком обозначают немую (x) и открытую струну (o).
«x» означает, что вы «заглушаете» или не играете на этой конкретной струне.
«о» означает, что вы играете на этой струне. Вы открываете струну.

Пример
В приведенном выше примере играет аккорд до мажор.

Нажмите указательным пальцем на струну B (2-я струна), 1-й лад (поместите палец сразу за первым ладом, не касайтесь ладов).

Нажмите вторым пальцем (средний палец) на струну D (4-я струна), 2-й лад
(сразу за вторым ладом).

Нажмите безымянным пальцем (безымянным пальцем) на струну А (5-я струна), 3-й лад
(сразу за третьим ладом)

Низкая E-струна (6-я струна) не воспроизводится или не приглушается.

Струна G (3-я струна) и высокая струна E (1-я струна) играются открытыми. Никакие пальцы здесь не давят на струну.

Теперь сыграйте правой рукой на всех пяти струнах одновременно (6-я струна не играет). Вуаля!

Если аккорд звучит не так хорошо, как хотелось бы, ознакомьтесь с 10 жизненно важными советами, которые помогут сделать ваши аккорды чистыми и ясными.

Числовое обозначение аккордов
Другой способ обозначения аккордов - числовой.Аккорд до мажор будет обозначаться следующим образом: x32010

.

То, что вы видите, - это лады, которые нужно нажимать. Чтение слева направо вы начинаете с нижней E-струны, A-струны, D-струны, G-струны, B-струны и высокой E-струны.

Первое, что вы видите слева, - это «x». Это означает, что вы «заглушаете» или «не играете» нижнюю струну ми. Затем вы видите цифру «3» на ля-струне, что означает 3-й лад на ля-струне. Затем 2-й лад на D-струне, G-струна играется открытой, 1-й лад на B-струне и, наконец, также играется открытая струна E.

Вы часто встретите этот тип обозначений в Интернете, потому что это намного проще и быстрее, чем создание диаграммы аккордов. Единственным недостатком является то, что вы не сможете увидеть, какой палец (указательный, средний, безымянный или мизинец) должен нажимать на струну, но для большинства гитаристов среднего уровня это не проблема.

Tab Chord Notation
А в табулатуре есть аккордовые обозначения. Также называется TAB.

Вы можете видеть на изображении ниже, что это в точности то же самое, что и числовая нотация аккордов.Единственная разница в том, что номера ладов теперь отображаются вертикально. Начиная снизу вверх вы увидите x32010.

В табулатуре нижняя строка E - это самая нижняя строка, а высокая E-строка - это верхняя строка, за ней следуют B-строка, G-строка, D-строка, а вторая нижняя строка - это A-строка. Снова числа указывают номера ладов, которые вы должны нажать на струну.


До мажор
e: ------- 0 ---------------------------------------- ---- |
B: ------- 1 ---------------------------------------- ---- |
G: ------- 0 ---------------------------------------- ---- |
D: ------- 2 ---------------------------------------- ---- |
A: ------- 3 ---------------------------------------- ---- |
Бывший---------------------------------------- ---- |
 

Получайте удовольствие, расширяя свой словарный запас по аккордам! Три аккорда и правда - вот что такое кантри-песня.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *