Вектор проставки: . Autovektor.su — — ,

Содержание

Информация о компании «ООО «Вектор»»

ООО «Вектор» находится в г. Москва, в пешей доступности от м. Автозаводская

Мы специализируемся на поставках любого автомобильного крепежа для оптовых и розничных потребителей Российской Федерации и стран СНГ.

Вы можете заказать товар с доставкой или забрать заказ в нашем магазине.

Купите продукцию в нашем интернет магазине и мы поможем Вам выбрать оптимальный способ доставки!

 

ООО «Вектор»  предлагает  полный  ассортимент аксессуаров для монтажа колесных дисков:

проставочные центровочные кольца из алюминия и термостойкого поликарбната, проставки колесные из прочного кованого алюминия, для согласования вылета колесного диска, болты колесные стандартной и увеличенной  длины, колесные гайки, а также шпильки забивные и резьбовые. 
Безопасность наших Клиентов является для нас приоритетным делом,  именно  поэтому  большое внимание уделяется средствам защиты колес от хищения.

Полный спектр колесных секреток «Вектор»  для автомобилей всех классов уже давно и хорошо  известен на внутреннем рыке России и  СНГ.

 

ООО «Вектор» предлагает  широкий ассортимент высококачественных товаров по сегменту «системы автомобильного крепежа» — болты колесные, гайки колесные, ключи специальные, шпильки колесные, секретки болты, секретки гайки, кольца центровочные, проставки и адаптеры,  вентили, колпачки для дисков и др.

В нашем ассортименте: колесные болты удлиненные, колесный болты с подстроечной шайбой,  колесный болт с вращающимся конусом,  хромированный колесный крепеж, гайки колесные, шпильки колесные, болты крепления колеса, гайки крепления колеса, болты на литые диски ВАЗ, цветные болты  и цветные гайки, секретки на колеса: комплект секретных болтов на колеса, комплект секретных гаек на колеса, секретки Вектор, секретки на литой диск, секретные болты на литой диск, проставки на колеса, проставки-адаптеры на колеса, проставки для увеличения колесной базы, шайба проставочная, шайба — проставка, проставка с направляющей, секретки на номера, секретки крепления номерного знака, кольца центровочные для дисков, пластмассовые центровочные кольца для дисков, кольца для ЦО дисков на автомобили Ниссан (Nissan), Хонда (Honda), Форд (Ford), Лексус (Lexus), Пежо, Мицубиши, Рено (Reno), Дэу (Dey), Тойота (Toyota), ВАЗ, Приора, Гранта, Калина.

 Колесный крепеж и аксессуары для литых дисков, цветные хромированные болты, цветные хромированные гайки на колеса, центровочные кольца, вентиля.

 В наличии всегда большой выбор колесных гаек, болтов,  шпилек для автомобилей импортного производства. Все шаги резьбы  и диаметры (М10, М12, М14, М16, D1/2″, 9/16”, 7/16” и т.д.), типы посадок (конус, сфера, плоская) множество вариантов покрытий. Более 400 наименований центровочных колец для дисков; колпачки на колесные болты; вентиля для б/к шин: стандартные и специальные для легкового, грузового и с/х автотранспорта, так же алюминиевые разборные; ключи баллонные и специальные и ещё многое другое.

Продукция ООО «Вектор»  изготавливается согласно последним технологиям,  отвечает  самим строгим стандартам качества. Колесные болты и гайки Вектор имеют  высокий  класс  прочности (для изделий с цинковым покрытием 10.9, а для изделий с хром/никелирование покрытием -12.9). Для обеспечений стойкости к воздействию окружающей среды и приданию детали отличного  внешнего вида, используется несколько видов покрытия – хромирование, оцинкование, а так же декоративные цветные покрытия.

Проставки на колеса Вектор

Компания «Вектор»  предлагает полный ассортимент шайб-проставок, а так же  адаптеров на колеса. Изготовлена продукция из высокопрочных, но легких материалов — алюминиевого сплава марки 6061-Т6 и 7075-Т6. В процессе производства используется современное оборудование — обрабатывающие центры и станки ЧПУ DECKEL MAHO (Германия), точность изготовления — 0,01мм. В обязательном порядке изделия проходят антикоррозионную обработку, используется самый высокопрочный крепеж 10,9.

 

Эксклюзивное изготовление колесных проставок по размерам Заказчика:  Если в нашем каталоге колесных проставок Вы не смогли найти, то что Вам нужно или Вас интересуют нестандартные переходные адаптеры, в том числе стальные, мы имеем возможность изготовления вышеперечисленных продуктов по Вашим параметрам. 

Новинка на рынке РФ: Новинка в серии колесных проставок — «ВЕКТОР ЭЛИТ». Она не имеет аналогов на рынке. Проставка изготовлена методом холодной ковки (использован алюминиевый сплав 7075-Т6). Сохранив малый вес этого изделия, нам удалось повысить  надежность и прочность продукта!

Каталог автомобильного крепежа Вектор представлен широкий ассортимент проставок разных  размеров. Вы сможете выбрать проставки, как для отечественных авто ВАЗ – Нива, Лада, Приора, Калина, Гранта; ГАЗ, УАЗ, так и проставки для иномарок: Lexus, Mercedes, Audi, BMW,  Nissan, Toyota, Infinity, Skoda, VW , Kia , Hyundai и многие другие. 

 

Секретки на колеса и секретки для номеров

Секретные болты и гайки  рассчитаны для того, что бы защитить колесные диски автомобилей от хищения. Высококачественные секретки из нашего ассортимента, изготовленные из высокопрочного материала защитят Ваш автомобиль от кражи. В арсенале ООО «Вектор»  широкий ассортимент секретных болтов и гаек различного вида и конструкции — от секреток  уровня эконом до премиум класса.

 

Основные преимущества секреток Вектор

·         ассортимент, охватывающий любые модели современного автотранспорта;

·         две серии секреток – эконом класс и премиум.

·         отличное соотношение цены и качества;

 

Секретки для крепления гос. знаков.  В наше неспокойное время кражи автомобильных номеров к сожалению далеко не редкость. Компания Вектор предлагает комплекты секреток номера для предотвращения подобных попыток.

В нашем каталоге Вы найдёте наборы секретных болтов и саморезов различной длины, а так же секретные винты для крепления номерных рамок, как на автомобили отечественного производства, так и на иномарки.

AJS проставки

Ступичные проставки отличная вещь для каждого автолюбителя и почти каждый хоть раз сталкивался с необходимостью их приобретения и установки.

И это не удивительно- с помощью ступичных проставок возможно разрешить множество вопросов: от серьезного увеличения клеи оси автомобиля при тюниге кузова и/или подвески, до простого и обыденного — «купил резину пошире- теперь цепляет» или тонкой настройки фитмента, когда вылет колесного диска важен до одного мм.

В нашем ассортименте представлены:

  • Проставки ступичные — проставки для изменения вылета колесного диска и расширения клеи, есть решения от 15 мм до 50 мм
  • Проставки ступичные переходные — проставки, позволяющие использовать на авто с редким посадочным размером шпилек/болтов колесные диски с более распространенной сверловкой.
  • Проставки универсальные — проставки небольшой толщины подходящие на множество посадочных размеров, тот самый вариант когда нужно то совсем чуть чуть. от 3 до 10 мм.
  • Хабы переходные (для ЦО) — переходные кольца и проставки для максимального качества центровки колесного диска на ступице.

Подавляющее большинство наших проставок изготовлены фрезеровкой из прочного и легкого алюминия — это довольно важно, большая точность и малый вес всегда ценились в деталях подвески, они позволяют не испортить управляемость увеличением неподрессоренных масс и избежать биений вращающихся деталей, в нашем случае колесных дисков. Многие проставки более 20 мм толщины поставляются с стальным крепежом, тк стандартного колесного крепежа точно не хватит на такую толщину, а подобная установка исключает сложных манипуляций по замене родных шпилек ступицы на удлиненные: Вы просто прикручиваете проставку на ступицу при помощи гаек из комплекта, а на шпильки проставки прикручиваете колесный диск. Центровка диска за счет центрального отверстия или при помощи конусных гаек из комплекта надежно и точно удерживающих проставку на шпильках ступицы.

ПРОСТАВКИ НА КОЛЕСА И ДИСКИ для увеличения вылета / Каталог / Starleks

Как выбрать проставки Показывать на странице 20 40 60 Все
Артикул Изображение Разболтовка Материал Крепление к диску Ступица Толщина Цена
1 шт.
В корзину
Показывать на странице 20 40 60 Все

204060Все

Проставки на колеса и диски

Тюнинг колес – это не просто замена старых дисков на новые или более интересные в плане дизайна. Здесь целый полигон для действий с весьма широкими возможностями. Если купить проставки для дисков, можно добиться очень многого! Что же они из себя представляют? Проставки на колеса – это специальные диски, которые монтируются между ступицей машины и колесным диском.

Проставки для увеличения вылета диска от Starleks

Представьте, что вы захотели на своем автомобиле установить не родной диск, который имеет совершенно другой способ крепления? Как быть? Понимая проблему, производители литых дисков стали выпускать свою продукцию с большим диаметром центрального отверстия, для того, чтобы любой автомобилист, используя проставочные кольца для дисков, смог оборудовать свою машину как ему нравится. Очень удобно! В данном случае жестко фиксируются проставочные кольца на ступицу, а колесо садится на шпильки колец.

Если вы хотите, чтобы ваш автомобиль выглядел современно и имел агрессивные черты внедорожника, вам просто необходимы проставки. Они не просто улучшат внешние характеристики машины, но и значительно повысят ее управляемость за счет увеличения дорожной калии.

Есть еще одна полезная опция, которая понравиться любому автомобилисту, особенно, если он еще и сам занимается ремонтом своего железного друга. Если использовать проставки для литых дисков, то это значительно упростит процедуру демонтажа колес, потому что после зимнего периода выполнить эту операцию очень затруднительно, так как колесо буквально прикипает к ступице. С такими детелями для дисков решить эту проблему можно в два счета.

Проставки на УАЗ – это, пожалуй, самый яркий пример того, каких необыкновенных преобразований можно достичь при помощи тюнинга колес . Используя их можно существенно изменить внешность машины за счет установки больших колес и шин размером 315х75. Более того, они помогут улучшить и проходимость автомобиля. Используя нашу продукцию для дисков bmw вы несомненно получите потрясающий результат. В нашем магазине имеются в продаже качественные проставки на уаз патриот, на ступицу ваз, включая ваз 2110. Также вы найдете широкий выбор комплектующих для тюнинга колес европейских автомобилей: проставки на форд всех моделей, проставки тойота, проставки на bmw, ваз 2110 и на ступицу УАЗ.

Проставки колесных дисков — стратегия выбора

Производитель автозапчастей предлагает проставки для дисков, которые, безусловно, ценны и полезны в своем применении. Но, это не означает, что ими можно пользоваться бездумно. Некоторые автовладельцы явно гонятся за толщиной, желая улучшить экстерьер своей машины. Нужно помнить, что ни в коем случае нельзя превышать границы допустимого вылета колес, которые предусмотрены заводом изготовителем авто, иначе вы рискуете тем, что ваша ступица останется один на один с асфальтом, а это может стоить жизни, либо получите быстрый износ подвески машины. Прежде чем делать такую покупку, нужно все очень хорошо взвесить.

И, пожалуй, очень важное замечание — колесные проставки для дисков должны иметь разную толщину для передней и задней оси. На заднюю ось, обычно, ставят более толстые из расчета (упрощенно) Nx[N*2], где N — толщина передней оси, а N*2 – толщина проставки задней оси.

Проставки Amortect. Сделано в России

Демпферные проставки, или баферы для пружин амортизаторов — тема не новая. А уж сколько копий было сломано по этому поводу, и не перечесть. И вот на рынке новый продукт — полиуретановые демпферные проставки Amortect. Продукт, разработанный и производимый в России, к которому, без сомнения, стоит присмотреться и который стоит проверить на практике.

Владимир Огородов

В ЧЕМ СОЛЬ?

Для чего вообще нужны демпферные проставки? Если кратко, то, по утверждению их производителей, они, во-первых, увеличивают клиренс автомобиля, во-вторых, оберегают стойки амортизаторов от пробоя, в-третьих, способствуют стабильному поведению автомобиля как при движении по прямой, так и в повороте, и, в-четвертых, улучшают динамический комфорт. В теории все верно. Что же касается воплощения идеи, то все не так очевидно. С увеличением дорожного просвета понятно: проставки, установленные между средними витками пружины, ограничивают ее сжатие, тем самым позволяя увеличить клиренс на 1–3 сантиметра. Величина зависит от типа пружины. А вот дальше все неоднозначно. Проставки, представленные на нашем рынке, изготовлены из разных материалов: есть и резиновые отечественные, и дешевые аналоги, изготовленные в Китае, и полиуретановые корейского производства, и… Перечислять можно и дальше. Но, как правило, все они обладают высокой степенью жесткости и практически «выключают» из работы среднюю часть пружины. А значит, заметно изменяют кинематику подвески, не позволяя ей оптимально отрабатывать как на неровностях дорожного покрытия, так и при динамичной езде. Пробоям подвески такие проставки сопротивляются успешно, но столь же «успешно» способствуют и передаче энергии ударов на опоры амортизаторов, то есть на элементы кузова. Да и сама пружина работает в не свойственном ей режиме, а значит, не исключена ее поломка.

ПОЧУВСТВУЙТЕ РАЗНИЦУ

Внешне демпферные проставки Amortect похожи на аналогичные продукты, но главное — во «внутреннем содержании» этого изделия. Для изготовления проставок Amortect используется высококачественный импортный полиуретан, а технология производства позволяет получить на выходе пластичный продукт с высокими характеристиками эластичности. Качество материала, используемого в производстве, доказано экспериментально. В научно-испытательной лаборатории конструкционных и строительных материалов «Политехтест» демпферные проставки Amortect подвергали самым суровым испытаниям, но даже при сжатии с усилием 20 тонн практически расплющенная деталь восстанавливала свою форму. Выдержала проставка и испытание морозом: даже охлажденная посредством жидкого азота до –40 °C и затем помещенная под пресс, она не утратила эластичности. А при испытании на разрыв проставка Amortect «сопротивлялась» до того момента, пока растяжение не превысило четырехкратный уровень. Выше уже говорилось, что некачественные демпферные проставки могут привести к поломке самой пружины. В лаборатории гибридных и наноструктурных материалов Московского института стали и сплавов прошли сравнительные испытания оригинальных пружин без проставок и пружин с полиуретановыми демпферными проставками Amortect. Результаты теста показали, что эти проставки под нагрузкой не блокируют работу средних витков пружины (использованный для изготовления высококачественный эластомер позволяет этой части пружины сжиматься до 45% от изначальной величины), но в то же время способствуют увеличению дорожного просвета автомобиля как в статике, так и в динамике. Можно говорить и о том, что демпферные проставки Amortect не только не вредят состоянию пружины, но и увеличивают ее ресурс.

ПЕРВЫЕ ВПЕЧАТЛЕНИЯ

Тестовый автомобиль с демпферными проставками Amortect, короткие субъективные испытания. Первое, что хотелось проверить, — это динамический комфорт в городских условиях. Согласитесь, перемещаться даже на небольшие расстояния на автомобиле, оснащенном излишне жесткой подвеской, весьма утомительно. Был готов к тому, что сразу столкнусь со всеми негативными аспектами «зажатого» шасси, но этого не произошло. Подвеска действительно стала жестче, нет, лучше сказать — сделалась более упругой. Пожалуй, стало передаваться чуть больше информации о неровностях дорожного покрытия, но это отнюдь не жесткое «считывание» дефектов асфальта. То есть та самая упругость подвески не пошла в ущерб комфорту. При этом при преодолении неровностей на повышенной скорости не происходит раскачки: амортизаторы работают с оптимальной амплитудой, быстро стабилизируя автомобиль.

Установка полиуретановых проставок Amortect не составляет труда.

Все остальное проверяли на закрытом для постороннего движения участке дороги. На традиционных упражнениях, таких как «змейка» и «лосиный тест», тестовый автомобиль демонстрирует меньшую, чем обычно, валкость. Кроме того, создается ощущение чуть более острого рулевого управления. Еще более показательным было экстренное торможение: в этом случае был минимизирован привычный «клевок», а это значит, что и задние колеса имели достаточный уровень сцепления с дорогой для эффективного торможения. В результате — более короткий тормозной путь. После длинной прямой, на которой автомобилем вполне комфортно можно управлять на скорости и 150 км/ч, пологая затяжная дуга поворота. Короткое торможение, разгон… На апексе скорость 120 км/ч, крены минимальные, автомобиль четко выдерживает траекторию движения. При этом активированная система стабилизации в процесс не вмешивается: внутренние по отношению к повороту колеса не теряют сцепления с дорогой, поэтому и «поводов для волнения» у ESP нет.

Автомобиль без проставок.

Автомобиль с проставками Amortect. Крены при выполнении «змейки» значительно снизились.

Что касается впечатлений от короткого теста, то в «сухом остатке» следующее: никаких нежелательных впечатлений от установленных демпферных проставок Amortect у меня не осталось, а вот то, как стала работать подвеска, показалось интересным. Теперь дело за ресурсными и инструментальными испытаниями.

СО ВСЕЙ СЕРЬЕЗНОСТЬЮ

Демпферные проставки — это та категория товаров, которые не требуют специальной сертификации. Но разработчики Amortect, в отличие от производителей аналогов, озаботились и этим пунктом: по результатам длительных протоколируемых испытаний ими был получен Сертификат соответствия ТР ТС «О безопасности колесных транспортных средств». Что же касается оригинальности конструкции и материала, используемого для производства демпферных проставок Amortect, то в августе прошлого года, накануне запуска изделия в производство, была подана заявка на патент. И на сегодняшний день разработчики полиуретановых демпферных проставок Amortect имеют патент как на форму модели, так и на технологию их изготовления. Все это говорит о том, что компания-производитель демпферных проставок Amortect готова к серьезной работе на российском рынке.

ИСПЫТАНИЯ НА ВИБРОСТЕНДЕ

Как влияет установка проставок на работу подвески мы выяснили на примере Renault Logan 2006 года выпуска с пробегом 156 000 км. До этого владелец не производил никаких вмешательств в подвеску — стойки и пружины стоят «родные» с завода. Смотрите, какие параметры выдаёт вибростенд до и после установки проставок Amortect:

ПРОЦЕСС УСТАНОВКИ И ИСПЫТАНИЯ ПРОСТАВОК AMORTECT:

 

Редакция рекомендует:






Хочу получать самые интересные статьи

Sixity 2 шт. 1,5 дюйма 2007 E-TON Vector 250R 4/110 Проставки задних колес

ПРЕИМУЩЕСТВА ШЕСТИРИНТА

Мы поставили перед собой задачу помочь стойким гонщикам на квадроциклах, мотоциклах и снегоходах найти доступные — и отличные — запасные части для своих машин. Под нашим собственным брендом Sixity вы найдете прецизионные детали для силовых автомобилей, созданные в соответствии со строгими требованиями, включая ведущие в отрасли мосты Sixity XT и XTA. С 2006 года бренд Sixity стал популярным выбором для наших клиентов, заботящихся о ценностях, с проверенными прочными и надежными характеристиками по всей линейке нашей продукции.

НАИЛУЧШИЕ ЗАПЧАСТИ ДЛЯ МОЩНОСТИ

На все наши запчасти под маркой Sixity предоставляется 100% гарантия на установку и ограниченную годовую гарантию, чтобы помочь гонщикам с уверенностью совершать покупки и находить запчасти, необходимые для ремонта своих машин. Запчасти под маркой Sixity включают в себя мосты для вездеходов и мостов для тяжелых условий эксплуатации, тормозные колодки для мотоциклов и квадроциклов из керамических, органических и спеченных материалов, а также колесные проставки для квадроциклов. Кроме того, наши компоненты охватывают все самые популярные марки автомобилей, включая Polaris, Arctic Cat, Yamaha, Honda, Can-Am, Kawasaki и другие.

ЗАПЧАСТИ ДЛЯ МОЩНОСТИ

Покупки с Sixity выходят далеко за рамки нашего розничного интернет-магазина. Помимо наших продуктов премиум-класса, мы также предлагаем практические руководства в форматах статей и видео, которые помогут вам в процессе частичной установки. Вы можете получить доступ к этим руководствам в любое время, что упростит, чем когда-либо, закончить ремонт и вернуться к разработке новой местности (с лишними деньгами).

ОТ POWERSPORTS ДО АВТОМАТИЧЕСКОГО АППАРАТА

Бренд Sixity появился в индустрии силовых видов спорта в 2006 году с внедорожных и тяжелых мостов для квадроциклов Sixity и качественных тормозных колодок Sixity для мотоциклов / квадроциклов.К 2013 году бренд расширился, включив в него линейку запасных частей для автомобилей, продаваемых на SixityAuto.com, eBay и Amazon. Недавно бренд Sixity стал частью Proximity Group ™, американского производителя и интернет-магазина (и гордого члена Better Business Bureau).

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ ОПЫТ ПОКУПКИ

По мере того, как мы продолжаем расти, наша цель — предоставить нашим клиентам наилучшие впечатления от покупок за счет непревзойденной стоимости, удобства и выбора.Мы стремимся выполнять наши основные принципы для нашей клиентской базы, которая заботится о ценностях, включая бесплатную * и быструю доставку, 100% гарантию соответствия, центр обслуживания клиентов в США и ограниченную годовую гарантию на детали под брендом Sixity.

Длина спейсерной последовательности рибосомного сайта связывания контролирует продукцию внутриклеточных и секретируемых белков Bacillus subtilis | Microbial Cell Factories

Среда и условия культивирования

E. coli DH5α [26] и B.subtilis TEB1030 [21] выращивали при 37 ° C во встряхиваемых колбах с 1/10 объема среды LB (10 г / л триптона, 10 г / л NaCl, 5 г / л дрожжевого экстракта), содержащей либо 100 мкг / мл ампициллина. ( E. coli ) или 50 мкг / мл канамицина ( B. subtilis ).

Трансформация

E. coli и B. subtilis

Трансформацию химически компетентных протопластов E. coli DH5α и B. subtilis TEB1030 проводили, как описано ранее [27, 28].

Экспрессионные культуры

Для экспрессии генов-мишеней 10 мл ночной культуры инокулировали одним трансформантом B. subtilis и выращивали при 37 ° C в аэробных условиях. Эту прекультуру использовали для инокуляции 10 мл основной культуры до плотности клеток (OD 580 нм ) 0,05. Экспрессионные культуры выращивали при 37 ° C в течение 6 ч в аэробных условиях. Затем измеряли плотность клеток и клетки отделяли от супернатанта центрифугированием (21000 × g , 10 мин), если это необходимо для дальнейших анализов.

Молекулярное клонирование

Клонирование генов проводили стандартными молекулярными методами [27]. Наборы для очистки нуклеиновых кислот были приобретены в Analytic Jena (Йена, Германия), а ферменты — в Thermo Fisher Scientific (Санкт-Леон-Рот, Германия).

Конструирование плазмид стандартной экспрессии

Гены-мишени для конструирования плазмид стандартной экспрессии (таблица 1) амплифицировали как фрагменты Nde I / Xba I с праймерами, перечисленными в дополнительном файле 1: Таблица S1 из различных матриц: GFPmut3 был взят из модифицированного pEBP41 [29], где мы удалили внутренний сайт Nde I с помощью QuikChange PCR ® [30] с использованием праймеров P1 и P2.Ген GUS ( uidA ) был амплифицирован из геномной ДНК E. coli DH5α. Слияния EXLX1 11 и , разрезанные 11 , соответственно, с последовательностями сигнального пептида SPepr , SPpel и SPbsn были амплифицированы из ранее созданной библиотеки сигнальных пептидов [31]. Все фрагменты гена были лигированы в Nde I / Xba I, гидролизованный E. coli B. subtilis челночный вектор pBSMul1 [22]. Эта стандартная экспрессионная плазмида содержит спейсер из 4 нуклеотидов и поэтому в данном исследовании называется pBS4nt.

Таблица 1 Плазмиды, использованные в этом исследовании

Конструирование векторов экспрессии с различной длиной спейсерной последовательности

Спейсерная последовательность между SD последовательностью и стартовым кодоном была увеличена за счет вставки аденозинов в спейсерную последовательность pBS4nt- SPepr разрезать 11 вектор с использованием QuikChange PCR ® [30] и праймеров P11 – P26 (дополнительный файл 1: таблица S1).Полученная серия векторов содержит спейсерные последовательности длиной от 5 до 12nt (как указано xnt в названии плазмиды). Впоследствии серия векторов pBSxnt- SPepr разрез 11 была гидролизована с использованием рестрикционных ферментов Nde I и Xba I, а также фрагментов Nde I / Xba I генов-мишеней GFPmut3 , ГУС, СПпель резка 11, СПбсн резка 11, СПепр EXLX1 11, СПпель EXLX1 11 и СПбсн EXLX1 11 были лигированы в эти плазмиды для создания серии векторов с разной длиной спейсера для каждого гена-мишени.

Мутагенез последовательностей спейсеров и скрининг библиотеки спейсеров

Спейсерная последовательность AAAACAT pBS7nt- GFPmut3 и pBS7nt- SPpel разрез 11 заменена на NNNNCAT (N = A, T, C, G ) с сохранением CAT и, следовательно, сайта рестрикции Nde I экспрессионной плазмиды (см. рис. 1) с использованием QuikChange PCR ® [30] и пар праймеров P27 / P28 и P29 / P30, соответственно (дополнительный файл 1: таблица S1). После преобразования г. coli DH5α, около 2000 отдельных клонов для каждого гена-мишени были смыты с чашек с агаром и плазмидная ДНК была выделена, в результате чего были получены библиотеки pBS7nt-4N- GFPmut3 и pBS7nt-4N- SPpel разрез 11 . Библиотеки были введены в B. subtilis TEB1030 и 908 клонов, продуцирующих варианты GFPmut3, а также 828 клонов, продуцирующих варианты SPPel-Cut-11, культивировали в качестве прекультуры в масштабе микротитрационного планшета (200 мкл селективной среды, 37 ° C, 900 об / мин. , 16 ч).Основные культуры получали как 20-кратное разведение предварительных культур свежей селективной средой, культивировали в течение 6 часов в тех же условиях и затем анализировали на внутриклеточную флуоресценцию GFP или внеклеточный Cut-11 (липолитическая активность и анализ расщепленного GFP). Наиболее эффективные клоны культивировали в трех биологических повторностях во встряхиваемых колбах (см. Выше раздел «Экспрессивные культуры») со стандартными конструкциями 7nt в качестве эталона.

Рис. 1

Нуклеотидный состав сайтов связывания рибосом плазмид pBS4nt – pBS12nt, показывающий разную длину спейсера.Последовательность Шайна-Дальгарно (SD) (красный), спейсер (зеленый) и начало целевого гена (синий) выделены. Сайт расщепления для Nde I, включая стартовый кодон (жирный шрифт), подчеркнут. Последовательности спейсеров варьировали по длине от 4 до 12 нт за счет встраивания аденозинов. Исходная плазмида pBSMul1 обозначена здесь как pBS4nt для обозначения длины спейсера

Конструирование плазмид с разными стартовыми сайтами трансляции

Для замены одного из двух различных стартовых кодонов трансляции (ATG) на ACG в серии плазмид pBSxnt- SPepr cut 11 , мутагенез QuikChange [30] был выполнен с парами праймеров P29 / 30, P31 / 32, P33 / 34, P35 / 36, P37 / 38, P39 / 40, P41 / 42, P43 / 44, P45 / 46 или P47 / 48 для замены первого ATG в каждом из вариантов спейсера (что приводит к pBSxnt- SPepr cut 11 _start2) или с парой праймеров P49 / 50 для замены второй ATG во всех вариантах спейсера (в результате pBSxnt- SPepr cut 11 _start1).

Анализ с разделением GFP

Количество секретируемой кутиназы Cut-11 и сволленина EXLX1-11 определяли с помощью анализа с разделением GFP. Усеченный фрагмент GFP1-10 (детектор) был продуцирован E. coli BL21 (DE3) с pET22- sfGFP1 10 , как описано ранее [31]. 20 мкл супернатанта культуры смешивали с 180 мкл раствора детектора и инкубировали при комнатной температуре не менее 16 часов. Флуоресценцию измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов Tecan Infinite M1000 Pro (Tecan, Männedorf, Швейцария).Для измерений флуоресценции использовались следующие параметры: λ Ex = 485 нм (ширина полосы 10 нм), λ Em = 505–550 нм (шаги 5 нм, ширина полосы 5 нм, усиление 120). Максимум испускания при 510 нм использовали для расчета относительных единиц флуоресценции.

Анализ активности кутиназы

Липолитическую активность Cut-11 измеряли с использованием хромогенного субстрата p -нитрофенилпальмитат ( p NPP), как описано Winkler and Stuckmann [32].Для приготовления раствора субстрата 15 мг p NPP (Sigma-Aldrich / Merck, Дармштадт, Германия) растворяли в 5 мл изопропанола и смешивали с 45 мл буфера Соренсена pH 8 (47,22 мМ Na 2 HPO 4 , 2,77 мМ KH 2 HPO 4 , 1,11 мг / мл гуммиарабика, 2,3 мг / мл дезоксихолевой кислоты натрия). Супернатанты культур разбавляли в десять раз 50 мМ трис-HCl (pH 8). 10 мкл разведенных супернатантов культур смешивали с 190 мкл раствора субстрата, инкубировали при 37 ° C и измеряли изменение поглощения при 410 нм в течение 15 мин с использованием планшет-ридера SpectraMax 250 (Molecular Devices, Биберах-ан-дер-Рисс, Германия). .Объемные активности (Ед / мл) рассчитывали с молярным коэффициентом поглощения p NP (15000 M −1 см −1 для используемых параметров реакции) и затем нормировали на плотность клеток (OD 580 ). .

Анализ активности GUS

Ферментативную активность GUS определяли с хромогенным субстратом p -нитрофенил-глюкуронид ( p NPG, Sigma-Aldrich / Merck, Дармштадт, Германия), как описано Cui et al. [33].Для последующего лизиса клеток 30 мкл экспрессионных культур GUS смешивали с 85 мкл буфера PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ NaCl 2 HPO 4 2H 2 O, 1,76 мМ KH 2 PO 4 , pH 7,4) и 5 ​​мкл раствора лизоцима 1 мг / мл в PBS и инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. Лизат клеток разводили в 20 раз буфером PBS и 50 мкл разведения смешивали с 50 мкл раствора субстрата (1,59 мМ p NPG в PBS) и инкубировали при 37 ° C в течение 2 мин.Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М Na 2 CO 3 . Адсорбцию при 410 нм измеряли с использованием планшет-ридера SpectraMax 250 (Molecular Devices, Biberach an der Riss, Германия). Объемная активность (Ед / мл) была рассчитана с использованием молярного коэффициента поглощения p NP (15 301 M -1 см -1 для используемых условий реакции) и нормирована на плотность клеток (OD 580 ). .

Измерение флуоресценции GFP

Количество внутриклеточного GFPmut3 определяли измерениями флуоресценции.Поэтому 50 мкл каждой экспрессионной культуры смешивали с 150 мкл трис-HCl, pH 8. Флуоресценцию измеряли с использованием считывающего устройства для микропланшетов Tecan Infinite M1000 Pro (Tecan, Männedorf, Swiss). Для измерений флуоресценции использовались следующие параметры: λ Ex = 495 нм (ширина полосы 5 нм), λ Em = 505–599 нм (шаг 2 нм, ширина полосы 5 нм, усиление 100). Для расчета относительных единиц флуоресценции использовали максимум излучения GFPmut3 [24] при 511 нм.

SDS-PAGE

Белки в клеточных фракциях и супернатантах различных экспрессионных культур анализировали с помощью SDS-PAGE, как описано Laemmli [34].Внеклеточные белки осаждали с использованием трихлоруксусной кислоты и дезоксихолевой кислоты натрия, как описано в [35]. Вкратце, 1 мл супернатанта культуры смешивали со 100 мкл 1% дезоксихолевой кислоты натрия и инкубировали на льду в течение 10 мин. Добавляли 100 мкл холодного 40% (об. / Об.) Раствора трихлоруксусной кислоты, и образцы инкубировали на льду в течение 20 минут. После этого образцы центрифугировали при 21000 × g в течение 30 мин. Супернатант отбрасывали, и осадок белка промывали 500 мкл ледяного 80% (об. / Об.) Ацетона.Осадок белка сушили в течение 10 мин и затем суспендировали в 50 мМ Трис-HCl pH 8 и 2 × SDS буфере для образцов (50 мМ Трис-HCl pH 6,8, 4% (мас. / Об.) SDS, 10% (об. / Об.) глицерин, 2% (об. / об.) β-меркаптоэтанол, 0,03% (мас. / об.) бромфенолового синего) до OD 580 нм из 15. Фракции клеток разводили непосредственно в буфере для образцов 2 × SDS для достижения OD 580 нм. из 15. Все образцы нагревали до 99 ° C в течение 10 мин. 15 мкл каждого образца разделяли в 16% геле SDS в камере «Mini Protean II Dual Slap Cell» (BioRad, Мюнхен, Германия) в течение 15 минут при 100 В и в течение 45 минут при 200 В.Разделенные белки выявляли окрашиванием кумасси бриллиантовым синим [10% (мас. / Об.) Сульфата аммония, 1% фосфорной кислоты, 0,1% (мас. / Об.) Кумасси бриллиантового синего R-250, 20% (об. / Об.) Метанола] с ночевкой.

Количественная ПЦР в реальном времени для определения количества транскрипта

Влияние длины спейсера на уровни транскрипта анализировали для каждого целевого гена с помощью RT-qPCR, как описано ранее [36]. РНК выделяли из 1 мл каждой экспрессионной культуры с использованием набора NucleoSpin ® RNA Kit (Macherey-Nagel, Düren, Германия).Синтез кДНК проводили с 1 мкг РНК с помощью набора Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Сент-Леон-Рот, Германия). RT-qPCR выполняли с использованием Maxima SYBR / ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Roth, Германия), 50 нг кДНК каждого образца и пар праймеров qPCR в реальном времени, показанных в дополнительном файле 1: Таблица S1. Анализ экспрессии генов выполняли с помощью программы REST 2009 (Qiagen, Hilden, Германия) с использованием метода 2 — ΔΔCT с предполагаемой эффективностью ПЦР 100% [37, 38].Уровень экспрессии соответствующего гена-мишени нормализовали до уровня конститутивно экспрессируемого гена основного сигма-фактора sigA и сравнивали с экспрессией того же гена-мишени с длиной спейсера 4nt.

Анализ in silico

Стабильность

РНК вокруг сайта старта трансляции рассчитывалась как минимальная свободная энергия (MFE) с помощью инструмента Vienna RNAfold [16, 39]. Свободная энергия Гиббса была рассчитана для окна 39nt, что соответствует количеству нуклеотидов, покрытых рибосомой [40].Это окно было сдвинуто между положением нуклеотида -50 и + 50 ниже и выше сайта старта трансляции + 1, что привело к 62 индивидуальным значениям MFE для каждого транскрипта. Скорость инициации трансляции каждой мРНК рассчитывали с помощью RBS Calculator v2.0 [17, 18]. Корреляционный анализ скорости инициации трансляции с экспериментально достигнутыми данными активности или флуоресценции проводили с использованием Microsoft EXCEL 2010 (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон, США).Для расчета коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r s ) с помощью EXCEL ранг каждой точки данных был рассчитан с использованием функции RANK.AVG, а затем корреляция ранжированных данных была рассчитана с помощью функции CORREL.

Внутригеномная неоднородность внутренней транскрибированной спейсерной рДНК у переносчика неотропической малярии Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae) | Журнал медицинской энтомологии

047″> Материалы и методы

051″> экстракцию ДНК, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), клонирование и секвенирование.

Геномная ДНК была выделена из отдельных комаров (Collins et al.1987). ITS-области амплифицировали в ПЦР 25- мкл мкл с использованием праймеров Porter and Collins (1991) и Wesson et al. (1992). Последовательности праймеров представляли собой 5′-CCTTTGTACACACCGCCCGT-3 ‘(отжигает до 18s) и 5′-ATGCTTAAATTTAGGGGGTA-3’ (отжигает до 28s). Реакции проводили в термоциклере PTC-100TM (MJ Research, Inc., Waltham, MA). Профиль ПЦР состоял из начальной денатурации в течение 3 минут при 94 ° C, затем 35 циклов денатурации при 95 ° C в течение 1 минуты, отжига в течение 1 минуты при 45 ° C и удлинения в течение 1.5 мин при 72 ° C. Дополнительный цикл включал продление на 15 мин при 72 ° C. Амплифицированные продукты ПЦР проверяли электрофорезом в 1,0% агарозном геле. Были задокументированы варианты размеров. Клонирование продуктов ПЦР проводили согласно протоколу Onyabe и Conn (1999). От двух до пяти экстрагированных плазмид, содержащих вставки (представляющих ITS и 5.8S-фрагменты от одного комара), секвенировали напрямую с использованием прямого (18S) и обратного (28S) праймеров с помощью набора для циклического секвенирования Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA).Образцы реакций проводили на автоматическом секвенаторе ABI 373 (Applied Biosystems).

Последовательности

выравнивали с помощью программного пакета Sequencher 3.0 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI), а затем оптимизировали вручную. Среднее нескорректированное значение P , рассчитанное в PAUP (Swofford 1998), было использовано для оценки дифференциации последовательностей внутри отдельных особей, внутри и между местностями. Индели рассматривались как единственная разница. Точно так же изменение количества повторов в блоках простых тандемных динуклеотидных повторов рассматривалось как одно различие, независимо от разницы в количестве повторов (Wesson et al.1992, Onyabe and Conn 1999). Пробелы обрабатывались как отсутствующие данные в PAUP, и, таким образом, две последовательности, которые отличались только отступом, давали нескорректированный P , равный 0,000. Анализ соединения соседей (NJ) был выполнен отдельно для обоих наборов данных ITS, чтобы определить, является ли An. aquasalis клоны были распределены по географическому принципу.

061″> Обсуждение

Несмотря на тесную связь между спейсерами ITS, ITS1 часто демонстрирует большую вариацию последовательности и длины по сравнению с ITS2 (Miller et al.1996 г., Tang et al. 1996 г., Beebe et al. 2000, Муха и др. 2002). Наши результаты подтверждают это наблюдение. Варианты ITS1 в пределах индивидуума An. aquasalis различались по длине на целых 200 оснований, тогда как последовательности ITS2 различались всего на четыре основания. Микросателлиты, по-видимому, являются источником внутригеномной неоднородности в ITS1. Похожая картина была обнаружена у двух размножающихся афротропических комаров, An. melas Theobald и An. merus Doenitz (Паскевиц и др., 1993). Это исследование выявило несколько вариантов длины ITS1 в диапазоне от 1.От 25 до 5,5 т.п.н., что связано с переменным числом тандемных повторов. Хорошо задокументированные в мультигенных семьях (Harris and Crandall 2000, Beltrame-Botelho et al. 2005), микросателлитные локусы предрасположены к вариациям за счет неравного кроссинговера и ошибочного спаривания со скользящей цепью (Levinson and Gutman 1987, Schlötterer and Tautz 1992).

Динуклеотидные повторы в ITS1 в диапазоне длин многих зарегистрированных микросателлитных локусов не были обнаружены в других подродах анофелина или родов Culicidae, о которых сообщалось в GenBank [e.г., Anopheles ( Cellia ) minimus Theobald, AF194481; Anopheles ( Anopheles ) pseudopunctipennis Theobald, U49735; Culex ( Culex ) salinarius Coquillett, U22144; Culex ( Melanoconion ) erraticus (Дьяр и Кнаб), U33021; Culex ( Mochlostyrax ) pilosus (Дьяр и Кнаб), U33028; Ochlerotatus punctor (Kirby), U48378; Aedes ( Stegomyia ) aegypti (L.), M95126; и Toxorhynchites amboinensis (Doleschall), U48377]. Хотя их целью было создание олигонуклеотидных зондов для разделения An. aquasalis от видов, которые морфологически похожи, Perera et al. (1998) обнаружили четыре тандемно повторяющихся звена длиной 36 п.н. в IGS An. aquasalis. Проблема с более длинными микросателлитами заключается в том, что они будут предпочтительно обнаруживаться в областях с множеством копий, таких как спейсеры, при использовании большинства методов микросателлитной гибридизации и могут привести к ложным результатам в популяционных исследованиях (обсуждаемых в Harris and Crandall 2000).

Эффективность согласованной эволюции при гомогенизации рДНК с помощью молекулярного привода и фиксации вариации последовательности и длины в семействе генов внутри скрещивающейся популяции или вида (Schlötterer and Tautz 1994) зависит от относительной скорости неравного кроссинговера и конверсии генов. против мутации (Перельсон и Белл, 1977). Настоящие данные свидетельствуют о том, что частота мутаций, особенно в ITS1, превышает скорость гомогенизации за счет механизма молекулярного драйва.Если частота мутаций высока по сравнению со скоростью гомогенизации, неравный кроссинговер может увеличить гетерогенность среди копий мультигенных семейств (Perelson and Bell 1977). фон дер Шуленбург и др. (2001) предложили высокие скорости замещения в сочетании с неэффективной гомогенизацией между повторами, чтобы учесть высокие скорости эволюционных изменений, характерных для повторяющихся элементов в ITS1 у кокцинеллид.

У шести из 17 исследованных нами лиц (SNF 7007, ZVZ 7003 и 7004, RJM 7000 и 7001 и AUC 9119) мы обнаружили одну последовательность ITS2, но несколько последовательностей в ITS1.Биби и др. (2000) обнаружили аналогичную ситуацию в Anopheles farauti Laveran s.s. и предположили, что наиболее вероятным объяснением является то, что внутрихромосомные обмены произошли в ITS1.

Обследование содержания GC в двух спейсерных областях у нескольких растений и животных показало, что наибольшее колебание составляет от 2 до 5%, за одним исключением (Torres et al. 1990). Мы нашли в An. aquasalis содержание GC в ITS1 (42,17%) было значительно ниже, чем в ITS2 (53,77%). Такая относительно большая разница между этими спейсерами также была обнаружена у африканских мошек (Tang et al.1996), у европейских стрекоз из рода Calopteryx (Weekers et al. 2001) и у некоторых видов тараканов (Mukha et al. 2002). Механизм, предложенный Торресом и др. (1990), что ITSs при функциональных ограничениях демонстрируют молекулярную коэволюцию по отношению друг к другу и к сегментам экспансии, расположенным в кодирующей области 28S рДНК, не может быть универсально применимым.

Для того, чтобы варианты последовательности ITS были полезны для филогенетического и популяционно-генетического анализа, они должны быть диагностически распределены между популяциями (Rich et al.1997) или географические регионы. Согласно нашему анализу NJ, последовательности ни из ITS1, ни из ITS2 не имели диагностического распределения или были информативными при различении популяций, но наши результаты подтверждают статус одного вида для An. aquasalis.

070″> Цитированная литература

1982

.

рДНК насекомых, стр. 205–263

. В [ред.],

Ядро клетки, т. Х

.

Academic

,

Нью-Йорк

.

.

2000

.

Популяции переносчиков малярии в юго-западной части Тихого океана Anopheles farauti s.s. выявляется с помощью рибосомной ДНК транскрибируется спейсерный полиморфизм

.

Наследие y

84

:

244

253

.

.

1993

.

Пространственное и временное распределение личинок анофелина в двух малярийных районах в штате Сукре, Венесуэла

.

Mem. Inst. Освальдо Круз

88

:

353

362

.

.

2005

.

Внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS) Trypanosoma rangeli рибосомной ДНК (рДНК): полезный маркер для межвидовой дифференцировки

.

Заражение. Genet. Evol.

5

:

17

28

.

.

1999

.

Пространственные и временные модели завозных случаев малярии и местной передачи в Тринидаде

.

г. J. Trop. Med. Hyg.

61

:

513

517

.

.

1992

.

Вспышка малярии Plasmodium vivax в Тринидаде. Вест-Индия: предварительное исследование

.

Ann. Троп. Med. Паразитол.

81

:

151

161

.

.

1996

.

Обзор использования рибосомальной ДНК (рДНК) для дифференциации загадочных Anopheles видов

.

Insect Mol. Биол.

5

:

1

9

.

.

1987

.

Зонд гена рибосомной РНК дифференцирует виды, входящие в состав комплекса Anopheles gambiae

.

г. J. Trop. Med. Hyg.

37

:

37

41

.

.

1948

.

Notas sôbre a distribuição e a biologia dos anofelinos das regiões Nordestina e Amazonica do Brasil

.

Rev. Serv. Esp. Saude Publ.

4

:

827

965

.

1982

.

Молекулярный драйв: сплоченный способ эволюции видов

.

Природа (Лондон)

299

:

111

117

.

.

2002

.

Оценка дельты реки Амазонки как барьера для потока генов регионального переносчика малярии Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae) на северо-востоке Бразилии

.

J. Med. Энтомол.

39

:

861

869

.

1980

.

Исследования комаров (Diptera: Culicidae) XXXIV. Ревизия секции Albimanus подрода Nyssorhynchus из Anopheles

.

Contrib. Являюсь. Энтомол. Inst. (Анн-Арбор)

15

:

1

215

.

.

1969

.

Передача информации при конверсии мейотических генов

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

62

:

96

103

.

.

1994

.

Анализ последовательности внутреннего транскрибированного спейсера 2 рибосомальной ДНК из популяций Anopheles nuneztovari (Diptera: Culicidae)

.

Мол. Биол. Evol.

11

:

406

416

.

1998 год

.

Анализ последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера 2 рДНК пяти видов южноамериканских малярийных комаров

.

ДНК Seq.

8

:

215

221

.

.

2002

.

Генетическая дифференциация переносчиков африканской малярии, Anopheles gambiae s.s., и проблема таксономического статуса

.

Генетика

161

:

1561

1578

.

2004

.

Классификация рода Anopheles (Diptera: Culicidae): рабочая гипотеза филогенетических отношений

.

Бык. Энтомол. Res.

94

:

537

553

.

.

2000

.

Внутригеномная изменчивость в пределах ITS1 и ITS2 пресноводных раков (Decapoda: Cambaridae): значение для филогенетических и микросателлитных исследований

.

Мол. Биол. Evol.

17

:

284

291

.

.

1975

.

Организация, экспрессия и эволюция генов антител и других мультигенных семейств

.

Annu. Преподобный Жене.

9

:

305

353

.

.

2003

.

Молекулярная систематика Anopheles: от подродов к субпопуляциям

.

Annu. Преподобный Энтомол.

48

:

111

139

.

.

2002

.

Внутригеномная вариация рДНК ITS2 у вшей человека, Pediculus humanus: ITS2 не является подходящим маркером для популяционных исследований у этого вида

.

Insect Mol. Биол.

11

:

651

657

.

.

1987

.

Неправильное спаривание со скользящей цепью: основной механизм эволюции последовательности ДНК

.

Мол. Биол. Evol.

4

:

203

221

.

.

2000

.

Неоднородность переносчиков малярии в Южной Америке

.

г. Энтомол.

46

:

238

249

.

.

1999

.

Анализ последовательностей ДНК ITS2 из Бразилии Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae)

.

J. Med. Энтомол.

36

:

631

634

.

.

1999

.

Популяционная структура первичного переносчика малярии в Южной Америке, Anopheles darlingi , с использованием изофермента, случайной амплифицированной полиморфной ДНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 2 и морфологических маркеров

.

г. J. Trop. Med. Hyg.

60

:

364

376

.

.

1999

.

Анализ последовательности второго внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК в Anopheles oswaldoi (Diptera: Culicidae)

.

J. Med. Энтомол.

36

:

679

684

.

.

1996

.

Филогения четырнадцати видов комаров Culex , включая комплекс Culex pipiens , выведенная из внутренних транскрибированных спейсеров рибосомной ДНК

.

Insect Mol. Биол.

5

:

93

107

.

.

2002

.

Эволюция и содержание филогенетической информации повторяющейся единицы рибосомной ДНК у Blattodea (Insecta)

.

Insect Biochem. Мол. Биол.

32

:

951

960

.

.

1999

.

Внутригеномная гетерогенность спейсера рибосомной ДНК (ITS2) варьирует в зависимости от региона в переносчике неотропической малярии Anopheles nuneztovari (Diptera: Culicidae)

.

Insect Mol. Биол.

8

:

435

442

.

.

1993

.

Внутренние транскрибированные спейсеры рибосомной ДНК у пяти членов комплекса видов Anopheles gambiae

.

Insect Mol. Биол.

2

:

247

257

.

.

1977

.

Математические модели эволюции мультигенных семейств путем неравного скрещивания

.

Природа (Лондон)

265

:

304

310

.

.

1998

.

Видоспецифичные повторяющиеся единицы в межгенном спейсере цистрона рибосомной РНК Anopheles aquasalis Curry

.

г. J. Trop. Med. Hyg.

59

:

673

678

.

.

1991

.

Видовые диагностические различия во внутреннем транскрибируемом спейсере рибосомной ДНК от видов-братьев Anopheles freeborni и Anopheles hermsi (Diptera: Culicidae)

.

г. J. Trop. Med. Hyg.

45

:

271

279

.

и другие. .

2003

.

Переносчики малярии, эпидемиология и повторное появление Anopheles darlingi в Белене, Пара, Бразилия

.

J. Med. Энтомол.

40

:

379

386

.

.

1997

.

Неоднородность области внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS-2) в отдельных клещах оленя

.

Insect Mol. Биол.

6

:

123

129

.

.

2004

.

Неоднородность последовательностей ITS1 у мокрецов Culicoides impunctatus (Goetghebuer) предполагает, что популяция в Аргайл, Шотландия, может отличаться генетически

.

Геном

3

:

546

558

.

.

2000

.

Филогения Anophelinae (Diptera: Culicidae) по морфологическим признакам

.

Ann. Энтомол. Soc. Являюсь.

93

:

745

775

.

.

1992

.

Синтез проскальзывания простой последовательности ДНК

.

Nucleic Acids Res.

20

:

211

215

.

.

1994

.

Хромосомная гомогенность Drosophila рибосомных массивов предполагает, что внутрихромосомные обмены являются движущей силой согласованной эволюции

.

Curr. Биол.

4

:

777

783

.

1998 год

.

PAUP *: филогенетический анализ с использованием экономных (* и других методов)

.

Sinauer

,

Сандерленд, Массачусетс

.

.

1996

.

Внутривидовая гетерогенность внутреннего транскрибируемого спейсера рДНК в комплексе Simulium damnosum (Diptera: Simuliidae)

.

Мол. Биол. Evol.

13

:

244

252

.

.

1988

.

Полные последовательности генов рРНК Drosophila melanogaster J

.

Мол. Биол.

5

:

366

376

.

.

1990

.

GCбаланс во внутренних транскрибируемых спейсерах ITS 1 и ITS 2 генов ядерной рибосомной РНК

.

Мол. Evol.

30

:

170

181

.

.

1994

.

Эволюция и филогенетическая информативность области ITS-1 у тигрового жука Cicindela dorsalis

.

Мол. Биол. Evol.

11

:

393

405

.

фон дер Шуленбург

Дж. Х.

.

2001

.

Экстремальные изменения длины и длины первой рибосомной внутренней транскрибированной спейсера у божьих коровок (Coleoptera: Coccinellidae)

.

Мол. Биол. Evol.

18

:

648

660

.

.

2001

.

Филогенетические отношения, выведенные из рибосомных ITS-последовательностей и биогеографических паттернов у представителей рода Calopteryx (Насекомое: Odonata) в западном Средиземноморье и прилегающей зоне Западной Европы

.

Мол. Филогенет. Evol.

20

:

89

99

.

.

1992

.

Сравнение последовательностей и вторичной структуры ITS рДНК у комаров (Diptera: Culicidae)

.

Мол. Филогенет. Evol.

1

:

253

269

.

.

1980

.

Быстрая дупликация и потеря генов, кодирующих цепи гемоглобина

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

77

:

2158

2162

.

© 2005 Энтомологическое общество Америки

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), которая разрешает не -коммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь в журналы[email protected]

Вариации внутригеномной последовательности второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) рибосомальной ДНК вектора малярии Anopheles stephensi

Abstract

Последовательность рибосомной ДНК (рДНК) второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) является широко используемым молекулярным маркером для видовой идентификации или ограничения из-за наблюдаемой согласованной эволюции, которая, как полагают, гомогенизирует копии рДНК в скрещивающейся популяции. Однако сообщалось о внутривидовых различиях в ITS2 Anopheles stephensi .Это исследование сообщает о наличии вариации внутригеномной последовательности в ITS2-рДНК An . stephensi и выдвигает гипотезу о том, что наблюдаемые внутривидовые различия у этого вида могли быть результатом неоднозначной хроматограммы последовательности ДНК в результате внутригеномной гетерогенности. Anopheles stephensi , собранные из разных частей Индии, секвенировали на предмет полного ITS2 и вариабельной области 28S-рДНК (домены d1-d3). Внутригеномные вариации были обнаружены в области ITS2 всех An . stephensi секвенировали, но не наблюдали такой вариации в доменах с d1 по d3 28S-рДНК. Клонирование и секвенирование ITS2 через домен d3 области 28S рДНК из репрезентативных образцов из северной, центральной и южной Индии подтвердили наличие внутригеномных вариаций в ITS2 из-за переходов в трех локусах и двух п.н. в динуклеотидном микросателлите. локус. Множественные гаплотипы наблюдались в ITS2, возникшем в результате таких вариаций. Из-за отсутствия детектируемой вариации внутригеномной последовательности в домене d1-d3 28S рДНК An . stephensi , этот регион может служить идеальной эталонной последовательностью для таксономических и филогенетических исследований. Перед использованием в качестве молекулярного маркера для определения границ видов или филогенетических анализов необходимо тщательно изучить наличие внутригеномных вариаций в рДНК.

Образец цитирования: Mishra S, Sharma G, Das MK, Pande V, Singh OP (2021) Внутригеномные вариации последовательности во втором внутреннем транскрибируемом спейсере (ITS2) рибосомной ДНК вектора малярии Anopheles stephensi .PLoS ONE 16 (6): e0253173. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253173

Редактор: Игорь В. Шарахов, Политехнический институт и университет штата Вирджиния, США

Поступила: 12 марта 2021 г .; Принята к печати: 28 мая 2021 г .; Опубликован: 14 июня 2021 г.

Авторские права: © 2021 Mishra et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Данные, лежащие в основе этого исследования, доступны в GenBank (инвентарные номера: MW676288 — MW676295; MW732930 — MW732931).

Финансирование: Это исследование было поддержано Министерством науки и технологий Индии, https://dst.gov.in/ (OPS) и ICMR-Senior Research Fellowship (SM и GS). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Anopheles stephensi является основным переносчиком малярии в Индии, особенно в городских условиях. Этот переносчик в основном встречается в городских районах из-за их предпочтения размножаться в чистой воде, особенно в цементных резервуарах, контейнерах, верхних резервуарах, цистернах, резервуарах для фонтанов и строительных площадках [1], которых много в городских районах. Возможно, благодаря адаптации к таким местам размножения, этот вид заселил несколько соседних территорий.Из-за инвазивного характера An . stephensi , в сочетании с высокой степенью инфицированности человеческими видами Plasmodium [2–4], этот переносчик малярии в настоящее время привлек внимание мирового здравоохранения.

Исторически сложилось так, что Ан . stephensi был зарегистрирован из региона Ближнего Востока и Южной Азии (Афганистан, Бахрейн, Бангладеш, Китай, Египет, Индия, Иран, Ирак, Оман, Пакистан, Саудовская Аравия, Таиланд) [1]. Согласно Шарме [5] An . stephensi — инвазивный вид, который сначала появился в портовых городах Индии и сначала вторгся в прибрежные города, а затем в города с избыточными колодцами. В течение последних нескольких десятилетий инвазии этого вида были зарегистрированы в Лакшадвипе (Индия) [6], Шри-Ланке [7–9], Республике Джибути [10], Эфиопии [11, 12] и Судане [13]. Anopheles stephensi в настоящее время поселяется в Африканских Рогах и способствует местной передаче малярии [14, 15]. Вследствие сообщений о вторжениях Всемирная организация здравоохранения [13] предупредила государства-члены ВОЗ и их партнеров-исполнителей в пострадавших странах о необходимости незамедлительно принять меры.

Молекулярные маркеры, в основном второй внутренний транскрибируемый спейсер (ITS2), рибосомная ДНК (рДНК) и цитохром с оксидаза, субъединица 1 (COI), часто используются для идентификации и подтверждения инвазии An . stephensi в нескольких странах [7, 8, 10–12, 15]. Другой ядерный маркер, интрон пахучего белка 1 (OBP1), как сообщается, идентифицирует биологические варианты An . stephensi [16] и на основании этого маркера наличие трех родственных видов в An .Было высказано предположение, что stephensi [17]. Рибосомная ДНК является предпочтительным и наиболее широко используемым молекулярным маркером для определения границ видов и разработки диагностических анализов видов, которые являются высококонсервативными в межпородной популяции из-за гомогенизации копий, которая, как считается, достигается за счет согласованной эволюции [24]. Рибосомная ДНК состоит из тандемно расположенных единиц ETS, 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 и 28S в нескольких сотнях копий у насекомых. Последовательности ДНК вариабельных областей 28S-рДНК, IGS и ITS2, в частности, часто используются для идентификации видов, определения границ видов и филогенетических анализов.28S рДНК является относительно консервативной областью, однако некоторые домены (d2 и d3) являются вариабельными и используются в качестве маркеров для дифференциации видов [18–23]. С другой стороны, вторая внутренняя транскрибируемая спейсерная область, которая относительно сильно варьирует среди разных видов из-за своей высокой скорости эволюции, является наиболее широко используемым таксономическим маркером для идентификации видов и филогенетических исследований. Однако у некоторых видов сообщалось о внутригеномных вариациях с наличием нескольких гаплотипов.Такие внутригеномные вариации создают проблему при секвенировании ДНК, особенно когда присутствует indel. Присутствие indel приводит к неоднозначному результату секвенирования, начиная с точки indel и далее, что может быть разрешено путем клонирования [24]. Наличие таких индексов привело к отправке неверных последовательностей в GenBank или опубликованных отчетах. Такое явление недавно наблюдалось в случае An . subpictus [25], и было отмечено, что все сообщенные внутривидовые различия в молекулярной форме (Форма A) An . subpictus на самом деле возник из-за неоднозначной хроматограммы последовательности ДНК, возникающей из-за наличия indel в одном из двух гаплотипов ITS2, присутствующих в каждом индивидууме. Поэтому выбор молекулярной области рДНК, которая может служить эталонными последовательностями для видовой идентификации, является важным, и следует избегать области, демонстрирующей внутригеномную гетерогенность. Более того, регистрация вариаций внутригеномных последовательностей в рДНК становится важной при представлении данных о последовательностях, чтобы избежать неоднозначности в таксономических и филогенетических исследованиях.

В случае Ан . stephensi , многочисленные последовательности ITS2 доступны в GenBank и исследовательских публикациях [2, 8, 10, 26–28]. Однако полиморфизм по длине и нуклеотидной последовательности наблюдался в последовательностях, о которых сообщалось из Ирана [26], Индии [28], и в нескольких последовательностях GenBank. Такой внутривидовой полиморфизм интригует. Однако в некоторых других отчетах из Индии [27], Саудовской Аравии [29], Эфиопии [11] и Шри-Ланки [8] внутривидовых различий отмечено не было.Одной из возможных причин, объясняющих сообщения о полиморфизме, является наличие внутригеномной вариации последовательности, о которой не позаботились во время анализа последовательности ДНК.

В этом исследовании мы охарактеризовали частичный 5.8S, полный ITS2 и частичный 28S (домены от d1 до d3) An . stephensi , чтобы исследовать внутригеномные вариации и очертить область рДНК, подходящую для молекулярной таксономии, которая может быть правильно секвенирована без необходимости клонирования.

Материалы и методы

Образцы комаров

Anopheles stephensi комара были собраны в разных частях Индии, т.е.е., Гуруграм (Харьяна), Нух (Харьяна), Алвар (Раджастан) и Нью-Дели из северной Индии, Ранчи (Джаркханд), Райпур (Чаттишгарх) и Гадхчироли (Махараштра) из центральной Индии, Гоа, Бангалор (Карнатака) Мангалор (Карнатака), Ченнаи (Тамил Наду) и Мисуру (Карнатака) из южной Индии (рис. 1). Географические координаты мест сбора представлены в Таблице 1. Отдельные комары сохранялись в пробирке для микроцентрифугирования, содержащей кусок обезвоженного силикагеля, и транспортировались в лабораторию в Дели.Комары были идентифицированы с помощью ключей Кристоферсом [30] до выделения ДНК.

Выделение ДНК и прямое секвенирование

ДНК

была выделена от индивидуальных самок комаров по методу Ливака [31]. Часть рДНК, охватывающую часть 5.8S рДНК, полный ITS2 и часть 28S рДНК (домены от d1 до d3), амплифицировали с использованием праймеров ITS2A (5′-TGT GAA CTG CAG GAC ACA T-3 ‘) [32] и D3B (5’-TCG GAA GGA ACC AGT TAC TA-3 ‘) [33]. Реакционная смесь для ПЦР (20 мкл) содержала 1X буфер, 1.5 мМ MgCl 2 , 200 мкМ каждого dNTP, 0,25 мкМ каждого праймера, 0,50 единицы полимеразы Taq (GoTaq ® , Promega Corporation Inc) и 0,5 мкл ДНК-матрицы. Условиями ПЦР были: начальная стадия денатурации при 95 ° C в течение 3 минут, затем по 35 циклов каждый с шагом денатурации при 95 ° C в течение 30 секунд, стадия отжига при 55 ° C в течение 30 секунд и стадия удлинения при 72 ° C. в течение 1,5 мин с последующим окончательным удлинением при 72 ° C в течение 7 мин. Качество продукта ПЦР проверяли на 1,5% агарозном геле в блоке документации УФ-геля.Продукты ПЦР подвергали секвенированию ДНК по методу Сэнгера. Продукты ПЦР обрабатывали Exo-Sap (ExoSAP-IT , Thermo Fisher, США) для удаления неиспользованных праймеров и дНТФ и подвергали реакции циклического секвенирования с использованием BigDye Terminator v3.2 (Invitrogen Inc., США) в соответствии с рекомендациями поставщика. протокол. Праймеры, использованные для реакции терминации секвенирования, были ITS2A, ITS2D (5′-TAT GCT TAA ATT CTG AGG GT-3 ‘), D2A (5′-AGT CGT GTT GCT TGA TAG TGC AG-3′) [34], D2B ( 5’-TTG GTC CGT GTT TCA AGA CGG G-3 ‘) [34], D3A (5′-GAC CCG TCT TGA AAC ACG GA-3’) [33] и D3B.Продукты реакции обрыва последовательности очищали с помощью осаждения этанолом и подвергали электрофорезу в ABI Prism 3730xl. Количество образцов, секвенированных из разных частей Индии, показано в таблице 1.

Клонирование и секвенирование

Для клонирования рДНК, охватывающая частичные 5.8S, ITS2 и частичные 28S, была сначала амплифицирована из шести отдельных самок комаров, по две от каждой из Нух (представляющих северную Индию), Гадчироли (центральная Индия) и Ченнаи (представляющая южную Индию) с использованием высокого fidelity ДНК-полимераза Taq для минимизации ошибок ПЦР.Реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) содержала по 0,5 мкМ каждого прямого и обратного праймеров (ITS2A и D3B), 0,50 единицы ДНК-полимеразы Phusion ® High-Fidelity, 5 мкл реакционного буфера 5X Phusion HF (все от New England Biolabs , США), 0,5 мкл 10 мМ предварительно смешанных дНТФ и 0,5 мкл гДНК. Условиями ПЦР были: начальная денатурация при 98 ° C в течение 30 секунд, 35 циклов каждого из денатурации при 98 ° C в течение 10 секунд, отжиг при 65 ° C в течение 30 секунд и удлинение при 72 ° C в течение 45 секунд, затем цикл окончательного удлинения при 72 ° C в течение 2 мин.Пять мкл продуктов ПЦР визуализировали на 1,5% агарозном геле, а оставшиеся очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR (Qiagen Inc, США) в соответствии с протоколом производителя. А-хвост был включен в 3′-конец очищенного продукта ПЦР путем инкубации 50 нг продукта ПЦР при 70 ° C в течение 20 мин в реакционной смеси (20 мкл), содержащей 1X буфер для ПЦР, 1,5 мМ MgCl 2 , 0,5 единицы ДНК-полимеразы Taq и 200 мкМ dATP. Четыре мкл очищенных продуктов ПЦР с A-хвостом лигировали с вектором pGEM-T easy (Promega Corporation), а затем 5 мкл этой лигированной смеси трансформировали в компетентные клетки DH5α (New England Biolab, США).Трансформированные культуры высевали на чашки с агаром Лурия-Бертани (LB), содержащим 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид (X-gal), изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG) и 50 мкг / мл ампициллина. Колонии белых трансформантов, происходящие от каждого комара, собирали и выделяли ДНК путем кипячения их в буфере ТЕ при 95 ° C. Плазмидную ДНК подвергали ПЦР с использованием праймеров ITS2 и D3B, а амплифицированные продукты с успешной вставкой, о чем свидетельствует размер продукта ПЦР на агарозном геле, обрабатывали Exo-Sap.Секвенирование плазмидной ДНК проводили с использованием праймеров ITS2A, ITS2D, D2A, D2B, D3A и D3B.

Результаты

Секвенирование клонированных продуктов ПЦР выявило наличие в общей сложности десяти гаплотипов. Последовательности всех гаплотипов доступны в GenBank (номера доступа MW676288 — MW676295, MW732930 — MW732931). Поскольку NCBI больше не принимает аннотации представленных последовательностей рДНК, из-за недавнего изменения политики подробности аннотации были предоставлены в файле S1. Полиморфизм в нуклеотидных последовательностях ограничивался только областью ITS2, а во фланкировании 5 полиморфизм не регистрировался.8S и домены от d1 до d3 28S. Выравнивание последовательностей ITS2 по отношению ко всем гаплотипам показано на рис. 2. Все гаплотипы получены из-за SNP в трех фиксированных локусах в области ITS2, т.е. переход C> T в положениях нуклеотидных оснований 172 и 383, G> A переход на 401, и два п.н. indel (CA) в положениях оснований 182–183 (нумерация положений оснований согласно фиг. 2). Чтобы избежать включения SNP в клонированные образцы в результате возможной ошибки ПЦР, предполагалось, что любой SNP, который присутствовал только в одном клоне, возник из-за ошибки ПЦР, и были исключены из анализа.Число секвенированных клонов и распределение гаплотипов в репрезентативных выборках из трех популяций показано в таблице 2. Hap-1 был доминирующим гаплотипом.

Рис. 2. Выравнивание гаплотипов полной последовательности ITS2 An . stephensi (фланкирующие последовательности 5.8S и 28S рДНК здесь не показаны).

Выделены полиморфные локусы (SNP в трех положениях оснований, т. Е. 172, 383 и 401; отступы на два п.н. в положениях оснований 182–183).Точка обозначает сходство с последовательностью Hap-1, а прочерк обозначает разрыв в нуклеотидной последовательности.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253173.g002

Прямое секвенирование и . stephensi из разных местностей, представляющих северную, центральную и южную Индию, также было выполнено для доменов ITS2 и d1-d3 28S-рДНК (таблица 1). Из-за присутствия indel в положениях оснований 182–183 ITS2, все последовательности были неоднозначными в считывании последовательностей за пределами этой точки (Рис. 3).Следовательно, прямые последовательности считывались до точки indel, а обратные последовательности считывались после точки indel. Смешанные основания наблюдались во всех полиморфных локусах, как видно при клональном секвенировании, во всех образцах. Однако было трудно распознать переход 383C> T в некоторых образцах и отличить его от шума из-за низкой площади пика T-аллеля. Результат показывает, что внутригеномная изменчивость универсальна, по крайней мере, в индийской популяции. Хроматограмма прямой последовательности также показала, что CA-микросателлит, присутствующий в ITS2 (позиции оснований 172–182), был диморфным (с шестью или семью повторами) и не очень полиморфным, как другие микросателлиты.Никакого полиморфизма не обнаружено в кодирующей рДНК (5.8S и домены d1-d3 28S).

Рис. 3. Снимки участков хроматограммы ITS2, показывающие полиморфные сайты.

Полиморфизм

172C> T и 182_183del можно увидеть в прямой последовательности (a), а 372C> T и 401G> A можно увидеть на хроматограмме обратной последовательности (b). Неоднозначность (смешанные основания) в последовательностях можно увидеть с точки отступа и далее (а).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253173.g003

Для исследования наличия смешанных гаплотипов в An . stephensi возникает из-за гибридизации типовой формы и var . mysorensis , по два человека каждой формы также секвенировали на ITS2 и 28S рДНК. Не было обнаружено различий в последовательности и характере внутригеномных вариаций.

Обсуждение

Последовательность рибосомальной ДНК является широко используемым молекулярным таксономическим маркером для идентификации / определения границ и филогенетических исследований благодаря гомогенизации копий рДНК в скрещивающейся популяции посредством наблюдаемой согласованной эволюции, что приводит к исключительно низкому или полному отсутствию внутриклеточных -видовая вариация.Среди регионов рДНК ITS2-рДНК является наиболее часто используемым молекулярным маркером, который демонстрирует чрезвычайно высокую межвидовую дифференциацию из-за высокой скорости эволюции, хотя остается в эволюционных ограничениях для поддержания специфических вторичных структур, которые обеспечивают функциональность [35] рДНК. Однако использование рДНК в молекулярной систематике и филогенетических исследованиях иногда становится проблематичным из-за внутригеномных вариаций, особенно из-за инделя. Внутригеномные вариации рДНК, особенно в некодирующей рДНК (ITS2 и IGS), не редкость и наблюдались у нескольких организмов, включая анофелины [36-40].Indel в некоторых копиях последовательности рДНК значительно влияет на качество последовательности ДНК, что приводит к коллапсу хроматограммы последовательности ДНК [24] ниже по течению до точки indel. Существуют случаи, когда такие внутригеномные вариации игнорируются, а потенциально неточные последовательности отправляются в GenBank или документируются в исследовательских статьях. Недавний отчет Sindhania et al. [25] выявили, что большинство ITS2-последовательностей представляет собой молекулярную форму An . subpictus (распространенный в основном на материковой части Индии, форма A), доступный в общественном достоянии, неверен из-за присутствия инделя в одном гаплотипе, которое не было замечено исследователями.Следовательно, создание качественной последовательности и документирование наличия внутригеномных вариаций в рДНК имеет важное значение для правильной молекулярной характеристики вида.

Последовательности ITS2 из и . stephensi были описаны несколькими авторами, но внутригеномные вариации остались незамеченными. Однако сообщалось о значительных внутривидовых вариациях ITS2. Предполагается, что наблюдаемый внутривидовой полиморфизм в ITS2 повышается из-за ухудшения качества последовательности.Такие внутривидовые вариации использовались для популяционно-генетического анализа [26], который может вводить в заблуждение. В исследовании, проведенном в Шри-Ланке [8], была представлена ​​только часть последовательностей, представляющая примерно половину сгенерированной последовательности (с использованием праймеров от 5.8S и 28S рДНК). Точно так же частичные последовательности были представлены из Африканского Рога [2]. Обрезка значительных частей последовательности ДНК в этих исследованиях, вероятно, происходит из-за неоднозначности, встречающейся при считывании последовательности из-за внутригеномных вариаций, в частности, отступов в микросателлитном локусе.Однако ни один из отчетов не документировал внутригеномные вариации, за исключением одной записи GenBank из Африканского Рога [2] (номер доступа: MN826065), где смешанные основания (G / A) были показаны в позиции основания 401. Наиболее вероятно, что внутригеномные вариации присутствуют за пределами Индии, что очевидно из того факта, что последовательности, доступные из общественного достояния из других стран, либо расходятся, либо описаны только фрагменты последовательностей. Однако наличие внутригеномной изменчивости в других странах требует подтверждения.Это исследование также показало, что полиморфные сайты фиксируются во всех изученных популяциях Индии. Аналогичное наблюдение было зафиксировано в случае An . subpictus (молекулярная форма A), где два гаплотипа ITS2 были обнаружены во всех популяциях от северной Индии до Шри-Ланки [25].

Наличие вариации внутригеномной последовательности в An . stephensi указывает на менее эффективную согласованную эволюцию, действующую на рДНК, что может быть связано с присутствием множества кластеров рДНК в геноме.Хотя точные механизмы наблюдаемой согласованной эволюции остаются неясными, считается, что гомогенизация рДНК происходит из-за множества геномных механизмов оборота, таких как неравный кроссинговер и генная конверсия [41]. Однако предсказано, что согласованная эволюция будет действовать менее эффективно на диспергированные единицы рДНК [42] из-за менее частой рекомбинации на гетерологичных хромосомах [43]. Локализация кластеров рДНК в An . stephensi с помощью флуоресцентной гибридизации in-situ (FISH) выявила присутствие рДНК как на X-, так и на Y-хромосомах [44], аналогично Drosophila melanogaster [45], где межхромосомные обмены, вероятно, менее эффективны для гомогенизации рДНК.Мы отметили внутригеномные вариации только в ITS2 (некодирующая рДНК), но не было обнаружено никаких доказательств внутригеномных вариаций в кодирующей рДНК, секвенированной в этом исследовании (частичные домены 5.8S и d1-d3 28S-рДНК). В нескольких отчетах, цитируемых Keller et al. [46] показали, что часто такие внутригеномные вариации ограничиваются некодирующими участками рДНК.

Из-за ограниченного числа секвенированных клонов может существовать возможность пропуска некоторых редких вариантов, если таковые имеются; хотя такие вариации, если они присутствуют в очень низкой частоте, не будут влиять на качество хроматограммы прямого секвенирования и полезность последовательности при определении границ видов или филогенетических исследованиях.Было показано [47], что копии ДНК, которые присутствуют в пропорции менее одной десятой, не имеют явных сигналов на хроматограмме последовательности. Все вариации мы наблюдали с помощью клонального секвенирования в An . stephensi можно увидеть на хроматограмме прямого секвенирования. Таким образом, внутригеномные вариации также могут быть обнаружены в большей степени путем тщательного изучения хроматограмм прямого секвенирования через глаз без необходимости клонирования. Однако качество последовательности ДНК с минимальным шумом в основе хроматограммы имеет решающее значение.Шум в последовательности ДНК можно значительно уменьшить, выбрав праймер для секвенирования, отличный от праймеров, которые использовались для амплификации ПЦР. Это исключает параллельное секвенирование артефактов ПЦР, таких как неспецифические продукты ПЦР, присутствующие в очень малых количествах, и димеры праймеров.

Вторая внутренняя транскрибируемая спейсерная область была широко используемым молекулярным маркером для характеристики видов, однако для этой цели также использовались кодирующие области рДНК. 28S-рДНК, которая считается высококонсервативной, менее часто использовалась в молекулярной систематике.Однако вариабельные области 28S-рДНК, т.е. домены D2 и D3 [18–23], продемонстрировали таксономическое значение и были использованы для разработки молекулярной дифференциации близкородственных видов / групп родственных братьев и сестер. В этом исследовании представлена ​​первая в мире эталонная последовательность An . stephensi для доменов от d1 до d3 28S рДНК. В этой области не обнаружено явных изменений внутригеномной последовательности. Следовательно, эту последовательность можно использовать в качестве эталонной последовательности для и . stephensi для молекулярной систематики.

Выводы

Из-за наличия вариаций внутригеномной последовательности в ITS2-рДНК An . stephensi , эта область не является подходящим молекулярным маркером для идентификации An . stephensi и молекулярно-филогенетический анализ. Последовательность 28S-рДНК (домены от d1 до d3) может служить в качестве превосходного молекулярного маркера для этой цели из-за отсутствия внутригеномных вариаций.

Благодарности

Авторы благодарны доктору Робину Марвалу за предоставленные образцы типовой формы и var mysorensis , доктору В.П. Оджха за предоставление комаров из Гадчироли, г-на Шри Бхагвана за сбор комаров из Ченнаи и г-на Удай Пракша и г-на Н.С. Бхакуни за техническую поддержку.

Список литературы

  1. 1. Даш А.П., Адак Т., Рагхавендра К., Сингх ОП. Биология и борьба с переносчиками малярии в Индии. 2007; Curr Sci: 92, 1571–1578.
  2. 2. Тадесс Ф.Г., Ашин Т., Тека Х., Эсайяс Э., Мессенджер Л.А., Чали В. и др. Anopheles stephensi комаров как переносчиков Plasmodium vivax и falciparum , Африканский Рог, 2019. Emerg Infect Dis. 2021; 27: 603–607. pmid: 33496217
  3. 3. Адак Т., Каур С., Сингх ОП. Сравнительная восприимчивость различных членов комплекса Anopheles culicifacies к Plasmodium vivax . Trans R Soc Trop Med Hyg.1999; 93: 573–7. pmid: 10717735
  4. 4. Каур С., Сингх О.П., Адак Т. Восприимчивость видов A, B и C комплекса Anopheles culicifacies к инфекциям Plasmodium yoelii yoelii и Plasmodium vinckei petteri . J Parasitol. 2000; 86: 1345–8. pmid: 111

  5. 5. Шарма В.П. Продолжающаяся проблема малярии в Индии. 2012; Curr Sci, 102: 678–682
  6. 6. Шарма СК, Хамзакоя К.К. Географическое распространение Anopheles stephensi, переносчика малярии в городах, и переносчика лихорадки денге / DHF Aedes aegypti на островах Аравийского моря в Лакшадвипе, Индия.Бюллетень Денге. 2001; 25: 88–91. https://apps.who.int/iris/handle/10665/148798
  7. 7. Gayan Dharmasiri AG, Perera AY, Harishchandra J, Herath H, Aravindan K, Jayasooriya HTR и др. Первое обнаружение Anopheles stephensi в Шри-Ланке: потенциальная проблема для предотвращения повторного интродукции малярии. Малар Дж. 2017; 16: 326. pmid: 28797253
  8. 8. Сурендран С.Н., Сивабалакришнан К., Гаджапати К., Артиан С., Джаядас ТТП, Карваннан К. и др. Генотип и биотип инвазивного Anopheles stephensi на острове Маннар в Шри-Ланке.Векторы паразитов. 2018; 11: 3. pmid: 29298698
  9. 9. Сурендран С.Н., Сивабалакришнан К., Сивасингхам А., Джаядас ТТП, Карваннан К., Сантирасегарам С. и др. Антропогенные факторы, способствующие недавнему расширению ареала переносчика малярии Anopheles stephensi . Фронт общественного здравоохранения. 2019; 7:53. pmid: 30923705
  10. 10. Faulde MK, Rueda LM, Khaireh BA. Первая запись об азиатском переносчике малярии Anopheles stephensi и его возможной роли в возобновлении малярии в Джибути, Африканский Рог.Acta Trop. 2014; 139: 39–43. pmid: 25004439
  11. 11. Картер Т.Э., Яред С., Гебресиласси А., Боннель В., Дамодаран Л., Лопес К. и др. Первое обнаружение Anopheles stephensi Liston, 1901 (Diptera: culicidae) в Эфиопии с использованием молекулярных и морфологических подходов. Acta Trop. 2018; 188: 180–186. pmid: 30189199
  12. 12. Балкью М., Мумба П., Денгела Д., Йоханнес Г., Гетачью Д., Яред С. и др. Географическое распространение Anopheles stephensi в восточной части Эфиопии.Векторы паразитов. 2020; 13:35. pmid: 31959237
  13. 13. ВОЗ. Предупреждение о переносчике: вторжение и распространение Anopheles stephensi. 26 августа 2019 г. https://www.who.int/news/item/26-08-2019-vector-alert-anopheles-stephensi-invasion-and-spread (дата обращения: 1 марта 2021 г.)
  14. 14. Сейфарт М., Хайрех Б.А., Абди А.А., Бух С.М., Фолд М.К. Через пять лет после первого обнаружения Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae) в Джибути, Африканский Рог: популяция устоялась — малярия появилась.Parasitol Res. 2019; 118: 725–732. pmid: 30671729
  15. 15. де Санти В.П., Хайрех Б.А., Чиниар Т., Прадинес Б., Тодон Н., Ларреше С. и др. Роль комаров Anopheles stephensi во вспышке малярии, Джибути, 2019 г. Emerg Infect Dis. 2021; 27: 1697–1700. pmid: 34013869
  16. 16. Gholizadeh S, Firooziyan S, Ladonni H, Hajipirloo HM, Djadid ND, Hosseini A, et al. Ген Anopheles stephensi одорант-связывающего белка 1 (AsteObp1): новый молекулярный маркер для диагностики биологических форм.Acta Trop. 2015; 146: 101–13. pmid: 25795618
  17. 17. Фирузиян С., Динпараст Джадид Н., Голизаде С. Предположение о возможности введения Anopheles stephensi в виде комплекса видов: предварительные данные, основанные на последовательности интрона I белка 1, связывающего пахучее вещество. Малар Дж. 2018; 17: 366. pmid: 30326917
  18. 18. Шарп Р.Г., Химс М.М., Харбах Р.Э., Бутлин Р.К. Методы идентификации видов группы Anopheles minimus на основе ПЦР: аллель-специфическая амплификация и однонитевой конформационный полиморфизм.Med Vet Entomol. 1999; 13: 265–73. pmid: 10514052
  19. 19. Сингх О.П., Чандра Д., Нанда Н., Рагхавендра К., Сунил С., Шарма С.К. и др. Дифференциация членов комплекса видов Anopheles fluviatilis с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции на основе последовательностей 28S рибосомной ДНК. Am J Trop Med Hyg. 2004; 70: 27–32. pmid: 14971694
  20. 20. Сингх О. П., Госвами Г., Нанда Н., Рагхавендра К., Чандра Д., Суббарао С. К.. Анализ аллель-специфической полимеразной цепной реакции для дифференциации членов комплекса Anopheles culicifacies .J Biosci. 2004; 29: 275–80. pmid: 15381848
  21. 21. Алам М.Т., Дас МК, Дев В., Ансари М.А., Шарма Ю.Д. Метод ПЦР-ПДРФ для идентификации четырех членов группы комаров Anopheles annularis (Diptera: Culicidae). Trans R Soc Trop Med Hyg. 2007; 101: 239–44. pmid: 16806334
  22. 22. Сингх О.П., Нанда Н., Чандра Д., Джа Д., Адак Т., Дуа В.К. и др. Модифицированный анализ на основе ПЦР для дифференциации членов комплекса Anopheles fluviatilis вследствие открытия нового криптического вида (вид V).Малар Дж. 2020; 19:96. pmid: 32103759
  23. 23. Рагхавендра К., Корнеле А.Дж., Редди Б.П., Коллинз Ф.Х., Нанда Н., Чандра Д. и др. Мультиплексный ПЦР-анализ и филогенетический анализ последовательностей, полученных из домена D2 28S рДНК, разделили членов комплекса Anopheles culicifacies на две группы: A / D и B / C / E. Заразить Genet Evol. 2009; 9: 271–7. pmid: 165
  24. 24. Beebe NW. Штрих-кодирование ДНК комаров: советы потенциальным старателям. Паразитология.2018; 145: 622–633. pmid: 29564995
  25. 25. Sindhania A, Das MK, Sharma G, Surendran SN, Kaushal BR, Lohani HP и др. Молекулярные формы Anopheles subpictus и Anopheles sundaicus на Индийском субконтиненте. Малар Дж. 2020; 19: 417. pmid: 33213479
  26. 26. Джадид Н.Д., Голизаде С., Агаджари М., Зехи А.Х., Раэиси А., Закери С. Генетический анализ локусов рДНК-ITS2 и RAPD в полевых популяциях переносчика малярии, Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae): значение для программы борьбы в Иране.Acta Trop. 2006; 97: 65–74. pmid: 16188214
  27. 27. Алам М.Т., Бора Х., Дас МК, Шарма Ю.Д. Тип и формы mysorensis Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae) в Индии обнаруживают идентичные последовательности рибосомной ДНК ITS2 и домена-3. Parasitol Res. 2008; 103: 75–80. pmid: 18309520
  28. 28. Бхиндер П., Чаудри А., Барна Б., Каур С. Мутации, индуцированные имидаклопридом и тиаметоксамом во внутреннем транскрибируемом спейсере 2 (ITS2) Anopheles stephensi .Toxicol Int. 2012; 19: 201–6. pmid: 22778521
  29. 29. Мунавар К., Салех А., Афзал М., Касим М., Хан К.А., Зафар М.И. и др. Молекулярная характеристика и филогенетический анализ комаров анофелина (Anophelinae: Culicidae) восточной и афротропической зоогеографических зон Саудовской Аравии. Acta Trop. 2020; 207: 105494. pmid: 32330453
  30. 30. Christophers SR. Фауна Британской Индии, включая Цейлон и Бирму. 1933, том IV, Diptera, семейство Culicidae, триба Anophelini; Лондон: Тейлор и Фрэнсис.371 с.
  31. 31. Ливак KJ. Организация и картирование последовательности на Drosophila melanogaster X- и Y-хромосомах, которая транскрибируется во время сперматогенеза. Генетика. 1984; 107: 611–34. pmid: 6430749
  32. 32. Биби Н.В., Сол А. Дискриминация всех членов комплекса Anopheles punctulatus с помощью полимеразной цепной реакции — анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Am J Trop Med Hyg. 1995; 53: 478–81. pmid: 7485705
  33. 33.Литвайтис М.К., Нанн Г., Томас В.К., Коче Т.Д. Молекулярный подход для идентификации турбеллярий мейофауны (Platyhelminthes, Turbellaria). Marine Biol. 1994; 120, 437–42.
  34. 34. Кэмпбелл BC, Штеффен-Кэмпбелл JD, Веррен JH. Филогения комплекса видов Nasonia (Hymenoptera: Pteromalidae), выведенная из последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) и 28S рДНК. Насекомое Mol Biol. 1993; 2: 225–37. pmid:

    60
  35. 35. Чжан В., Тиан В., Гао З, Ван Г, Чжао Х.Филогенетическая полезность структуры последовательности ITS2 рРНК при функциональных ограничениях. Int J Mol Sci. 2020 3; 21: 6395. pmid: 32899108
  36. 36. Безжонова О.В., Горячева И.И. Внутригеномная гетерогенность внутреннего транскрибируемого спейсера 2 рДНК в Anopheles messeae (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 2008; 45: 337–41. pmid: 18533424
  37. 37. Фэйрли Т.Л., Килпатрик С.В., Коннектикут Дж. Э. Внутригеномная гетерогенность внутренней транскрибированной спейсерной рДНК в неотропическом переносчике малярии Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae).J Med Entomol. 2005; 42: 795–800. pmid: 16365998
  38. 38. Ли К., Вилкерсон Р. Внутригеномная вариация ITS2 рДНК в неотропическом комплексе Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis (Diptera: Culicidae). J Hered. 2007; 98: 51–9. pmid: 17158469
  39. 39. Onyabe DY, Conn JE. Внутригеномная гетерогенность спейсера рибосомной ДНК (ITS2) варьирует в зависимости от региона у переносчика неотропической малярии Anopheles nuneztovari (Diptera: Culicidae).Насекомое Mol Biol. 1999; 8: 435–42. pmid: 10634969
  40. 40. Whang IJ, Jung J, Park JK, Min GS, Kim W. Внутригеномная вариация длины межгенного спейсера рибосомной ДНК в векторе малярии, Anopheles sinensis . Mol Cells. 2002; 14: 158–62. pmid: 12243346
  41. 41. Поланко С., Гонсалес А.И., де ла Фуэнте, Дувр, Джорджия. Мультигенное семейство рибосомальной ДНК в Drosophila melanogaster обнаруживает контрастирующие паттерны гомогенизации для IGS и ITS спейсерных областей.Возможный механизм разрешения этого парадокса. Генетика. 1998; 149: 243–56. pmid: 9584100
  42. 42. Айронсайд JE. Разнообразие и рекомбинация дисперсной рибосомной ДНК и генов, кодирующих белок в микроспоридиях. PLoS One. 2013; 8: e55878. pmid: 23405227
  43. 43. Гольдман А.С., Лихтен М. Эффективность мейотической рекомбинации между диспергированными последовательностями в Saccharomyces cerevisiae зависит от их хромосомного положения. Генетика. 1996; 144: 43–55 PMID: 8878672
  44. 44.Цзян X, Пири А., Холл А.Б., Шарма А., Чен XG, Уотерхаус Р.М. и др., Анализ генома крупного городского комара-переносчика малярии, Anopheles stephensi . Genome Biol. 2014; 15: 459. pmid: 25244985
  45. 45. Довер Г., Коэн Э. Спринг-очистка рибосомальной ДНК: модель мультигенной эволюции? Природа. 1981; 290: 731–2. pmid: 6783965
  46. 46. Келлер I., Chintauan-Marquier IC, Veltsos P, Nichols RA. Рибосомная ДНК кузнечика Podisma pedestris : бегство от согласованной эволюции.Генетика. 2006; 174: 863–74. pmid: 16951064
  47. 47. Шарма Д., Лазер М., Дайкс К.Л., Данг А.С., Адак Т., Сингх О.П. Расхождения в результатах генотипирования аллелей лекарственной устойчивости гена дигидрофолатредуктазы Plasmodium falciparum (Pfdhfr) с помощью аллель-специфической ПЦР (ASPCR) и секвенирования по Сэнгеру. Parasitol Res. 2016; 115: 323–8. pmid: 26407876

Делокализуемая катионная головная группа вместе с олиго-оксиэтиленовым спейсером в геминикатионных липидах улучшает их биологическую активность в качестве векторов плазмидной ДНК

Наноагрегаты липоплекса, состоящие из плазмидной ДНК (пДНК) pEGFP-C3 и смешанных катионных липосом, состоящих из нескольких процентов геминикатионного липида (GCL) оксиэтиленового ряда 1,2-бис (гексадецилимидазолия), называемого ( C 16 Im) 2 (C 2 O) n , с оксиэтиленовыми прокладками ( n = 1, 2 или 3) между катионными группами имидазолия и Цвиттерионный вспомогательный липид DOPE был охарактеризован с помощью различных биофизических и биологических подходов, проведенных с несколькими композициями GCL ( α ), а также с использованием либо массы, либо эффективного отношения зарядов липоплекса.Электрохимическое исследование с помощью ζ -потенциала подтверждает, что три GCL дают эффективный заряд на 10% ниже номинального, в то время как компактная пДНК дает только 25% эффективный отрицательный заряд. Исследование SAXS показывает, независимо от длины спейсера ( n ) и эффективного отношения зарядов ( ρ eff ), наличие двух пластинчатых структур, , т.е. , одна (L α , основной ) во всем составе ГКЛ и еще один (L α , DOPE, rich ) с более высокими значениями периодичности, сосуществующий с предыдущим при низком составе ГКЛ ( α = 0.2). Крио-ТЕМ-анализ показывает два типа многослойных структур, состоящих из катионных липидных бислоев с зажатой между ними пДНК: кластерного типа (C-тип) при низком уровне α = 0,2 и типа отпечатка пальца (FP-тип) при α ≥ 0,5, оба с одинаковым межламеллярным расстоянием ( d ) в соответствии с L α , основная структура , определенная методом SAXS. Эффективности трансфекции (TE) каждой липидной смеси определяли в четырех различных клеточных линиях (HEK293T, HeLa, Caco-2 и A549) при нескольких значениях α и ρ eff в отсутствие и в присутствии сыворотки ( FBS).Оптимизированные составы ( α = 0,2 и ρ eff = 2,0) значительно лучше трансфицируют клетки, чем коммерческий реагент для трансфекции, липофектамин 2000 и ранее изученные эффективные липоплексы, содержащие другие катионные головные группы или спейсеры в отсутствие и наличие сыворотки. Активность оптимизированных составов может быть объяснена комбинацией нескольких факторов, таких как: (а) фузогенный характер ДОФЭ, который приводит к более высокой текучести липоплексов при α = 0.2, (b) сосуществование двух ламеллярных структур при α = 0,2, что синергетично TE этих липидных векторов, и, главным образом, (c) более высокая биосовместимость GCL, описанная в этой работе, благодаря присутствию двух катионных групп имидазолия. вместе с олиго-оксиэтиленовым спейсером. Длина спейсера в GCL, кажется, оказывает меньшее влияние, хотя (C 16 Im) 2 (C 2 O) n / DOPE-pDNA липоплексы с n = 1 и 3 показывают более высокую трансфекцию гена, чем n = 2.Все описанные здесь оптимальные составы являются высокоэффективными с незначительными уровнями токсичности и, таким образом, могут рассматриваться как очень многообещающие генные векторы для приложений in vivo .

FSA VISION Vector Carbon Clip-On AeroBar распорки Новые рули для спортивных товаров romeinformation.it

FSA VISION Vector Carbon Clip-On AeroBar распорки Новый



FSA VISION Vector Carbon Clip-On AeroBar распорки Новый

Новинка, FSA VISION Vector Carbon Clip-On AeroBar распорки.100% оригинал и подлинность. Винты в комплекте. Прокладка 2×20мм ..

FSA VISION Vector Carbon Clip-On AeroBar распорки Новый

1 шт. Рукава Одноцветные рукава для велоспорта Покрытие на рукава Походные нарукавники, водные завязки для 3/4 «поводьев Кожа дуба Германа от Weaver Новинка Бесплатная доставка. Shimano XT BL-M785 BL-T785 Крышка тормозного рычага слева, Велосипедные нагрудники Шорты Горный велосипед Дышащие велосипедные гелевые колготки с мягкой подкладкой для триатлона.3 / 8-10 Техническая беседка Набор штифтов приводных штифтов Инструмент для создания бильярдных кий, с длинным рукавом Мужчины Велоспорт Джерси Рубашка Шорты с нагрудником Набор 2019 M Short.Женские лыжи Blizzard Cheyenne 2017 с Tyrolia Attack2 11 GW Bindings 163 или 1. S ARD Тяжелая атлетика Тренировка в тренажерном зале Широкая опора для спины Неопрен, дерево Крышка крючков для креветок Джиг-кальмар Крючок для зонта Крючок для шляпы Протектор коробки 25 мм, 56 60 62 Зима ВОДОНЕПРОНИЦАЕМЫЙ Ящик BLANKET Pony Маленькая лошадь СИНИЙ ФИОЛЕТОВЫЙ, Тяжелая атлетика Кожаный силовой пояс RCG Быстроразъемный синий для тренировок в тренажерном зале. Вязаные крючком велосипедные перчатки Merckx с флагом Бельгии L’Eroica, Sitka ESW Glove Elevated II Early Season Whitetail, RUGER FIREARMS ЧЕРНЫЙ / СИНИЙ * Нашивка с вышивкой * 3 дюйма x 3/4 дюйма.Жесткий футляр Champion White 1X1 для бильярдного бильярда Тренажер Aim, 10 пар грелок для ног Прочная наклейка с наклейками Winter Body Warm Thermal Paste.Petzl Pixa 3R Headlamp Black Yellow New, Nike sz M / M Vapor FLASH женские перчатки для бега NEW $ 65 NRG92023 Сенсорный экран, НОВИНКА Intrepid International One Person Horse Twitch остается на месте. конский волос STAMPEDE STRING коричневая шляпная нить с полной петлей COWBOY HAT. Молодежный мягкий защитный спортивный кубок Youper Boys для детей от 7 до 12 лет, черный, 26 x 1.95-дюймовая шина Schwinn для горных велосипедов, тактический жилет YAKEDA Outdoor Ultra-Light Breathable Combat Training Vest Black. Детский надувной жилет для плавания Спасательный жилет Пляжный туризм Устройство для плавания Вода IfINd, 100x алюминиевые рукава премиум-класса для моноволокна Rigging Trace Leader Crimps SU,

29 Обработка вертикального сужения нижнего века с помощью распорок



10.1055 / b-0038-165862

29 Лечение вертикального сужения нижнего века с помощью спейсеров

Дирк Рихтер и Нина Швайгер

Резюме

В этой главе описаны все типы вертикальных ограничений нижнего века, относящиеся к передней рубцевание средней или задней ламеллы.Мы также демонстрируем различные виды спейсеров, а также использование поднадкостничного подъема средней зоны лица для восстановления кожи.




29.1 Вертикальное ограничение во всех ламелях



29.1.1 История пациента, ведущая к конкретной проблеме

Пациент 40 лет в анамнезе перенес блефаропластику нижнего века 1 год назад с распределением жира и Трансконъюнктивальная ревизионная операция по пересмотру склерального изображения первой операции (рис.29-1). Он был здоровым некурящим и не имел серьезных проблем со здоровьем.

Рис. 29.1 (а, б) Пациент 40 лет со склеральным просветом 3 мм после двух предыдущих операций. Вертикальное ограничение во всех ламелях. Отрицательный вектор.


29.1.2 Анатомическое описание текущего состояния пациента

Пациент имеет общую проблему втягивания нижнего века после операции на нижнем веке. Это может быть связано с чрезмерным рассечением кожи или мышечной денервацией на передней пластинке, гематомой или инфекцией на средней пластинке или на уровне задней пластинки с сокращением конъюнктивы или мышцы Мюллера после транспальпебрального доступа или болезни Грейвса.Неправильное положение нижнего века часто наблюдается у пациентов с негативными векторами, у которых отсутствует опора нижнего века из мягких тканей или костных структур. Следует внимательно проанализировать историю болезни пациента и анатомическую ситуацию в соответствии с ламелями.

Он сообщает в анамнезе тяжелую гематому, особенно на правой стороне после операции, с длительным отеком, хемозом и эктропионом в течение нескольких месяцев, которые лечили консервативно.



Анализ проблемы

Пациент показывает умеренный отрицательный наклон обоих глаз, вертикальное ограничение средней ламеллы с горизонтальным удлинением века на 6 мм слева и 8 мм справа, склеральное выступление на 3 мм справа и 2 мм левая сторона, сохраняющаяся деформация слезной канавки и отрицательный вектор со значением Hertel 22 справа и 21 слева.Имеется полное активное закрытие век, но при пассивном закрытии век наблюдается лагофтальм 2 мм. Нет конъюнктивальной инъекции или хемоза. Мигание во всех трех частях круговой мышцы является нормальным с эффектом «рыбьего рта».



Диагноз

Это сложное неправильное положение нижнего века с небольшим кожным дефектом и срединным рубцеванием ламеллярного века, выступающими глазами, горизонтальным удлинением век и эстетической деформацией маргинальной дуги. Имеется слабая ретракция кзади без нарушения конъюнктивы.



29.1.3 Рекомендуемое решение проблемы


  • Преобразуйте пациента с отрицательным вектором в нормальный вектор с помощью поднадкостничной подтяжки средней зоны лица.


  • Привлечение кожи и снятие вертикального ограничения с помощью поднадкостничного лифтинга средней зоны лица.


  • Лечение дряблости горизонтального века путем кантопексии с костной фиксацией с левой стороны и процедурой полоски предплюсны с правой стороны.


  • Поддержка и реконструкция средней пластинки с помощью бесклеточного дермального матрикса (ADM).



29.1.4 Техника

Ревизионная процедура начинается с поднадкостничной подтяжки средней зоны лица, как описано Hester et al., С переднего разреза кожи. Все прикрепления от перегородки к краю глазницы и от надкостницы до вестибулума освобождаются, чтобы освободить всю щеку. Надкостница надрезана на низком уровне. Два шва 3–0 PDS используются, чтобы приподнять всю щеку и восстановить кожу. Делается два сверла на уровне зрачка и 1.5 см сбоку от края глазницы для надежной фиксации. Просверливаются еще два отверстия на скулово-височном шве для кантопексии (рис. 29-2).

Рис. 29.2 (a) Передний разрез кожи и приближение к задней пластинке; (б) раскалывание ретракторов; (c) поднадкостничный лифтинг средней зоны лица с просверливанием отверстий на уровне зрачка и на 1,5 см сбоку для двухточечной фиксации; (d) вертикальное возвышение с 3–0 неразрушающимися швами.

ADM, толщиной 1 мм (Permacol), вшивают в промежуток между пластиной предплюсны и перегородкой с помощью 5–0 Vicryl, стараясь не пришить его к кости, чтобы крышка не оставалась неподвижной (рис.29-3).

Рис. 29.3 Взаимодействие ADM (Permacol) и фиксация 5–0 рассасывающимися швами.

Кантопексия с 4–0 проленом выполняется методом мостовидного протеза через кость, чтобы выскользнуть на орбиту и предотвратить латеральное смещение кантального отверстия. С правой стороны добавлена ​​процедура тарзальной полоски для решения проблемы горизонтального удлинения века (рис. 29-4).

Рис. 29.4 Просверлить кантопексию с укорачиванием тарзальной планки.


29.1.5 Послеоперационные фотографии и критическая оценка результатов

Рис.29-5a показан пациент через 10 дней, показано точное положение края нижнего века, касающегося лимба, и отсутствие склеральных выступов. Хорошая поддержка структур нижнего века достигается преобразованием в вектор нормали. На рис. 29-5б, в показано полное закрытие крышки через 1 год.

Рис. 29,5 (a) Через 10 дней и (b, c) через 1 год после операции.
Только золотые участники могут продолжить чтение.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *