Лада гранта метки грм: Замена ГРМ Лада Гранта 8 клапанов, схема и метки ГРМ

Рахул Рой

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и компьютерной биологии Университета Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

¹ Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования полиэтиленгликоля (PEG) поверхности 9000

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Аннотация

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие, эти методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Частично это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) по Фёрстеру (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих общепринятых протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » ¹ . Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это ^{2, 3} . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели мы предлагаем краткое, но практическое руководство по измерениям одиночных молекул FRET ⁴ (smFRET) ^5-7 , одному из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного зарождения в неводных условиях в 1996 г. ⁸ smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, фолдинге и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, фолдинге белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в этой области и ссылкам в них ^{6, 9-13} .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () ^{4, 14, 15} . Эта эффективность передачи энергии E задается как E = [1 + ( R / R ₀ ) ⁶ ] ^-1 , где R — расстояние между красителями. и R ₀ — это радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределений популяций расстояний между красителями ^16-19 . Однако возможность контролировать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию ^{20, 21} , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных ^{5, 22} . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией ⁷ с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R ₀ = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R ₀ , E = 0,5, а на меньших расстояниях это> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R ₀ .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки ⁹³ , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Вставка 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R ₀ . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

Схема эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции ε > 50 000 M ⁻¹ см ⁻¹ ; квантовый выход QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством биоконъюгированных химикатов. Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET ²³ , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET ²⁴ за счет химического подавления их мерцания ²⁵ , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры — это небольшие (<1 нм) органические красители ²⁶ . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, алекса- и атто-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Sua Myong, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители для ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат эффективными однокомолекулярными красителями и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

Краситель	Возбуждение λ макс. (нм)	Излучение λ макс.	Фотостабильность (и) b (в Trolox / β ME)
Доноры
Cy3	550 1	91/50
ATTO550	554	577	1,9	72/27 c
Alexa555	555	567	0,85	0,85
Акцепторы
Cy5	655	667	1. 0	82/25
ATTO3647N	ATTO3647N	62/31
Alexa647	650	667	1,2	58/20 c

Повышение фотостабильности

Молекулярный кислород является эффективным тройным гасителем состояния красителя также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание ²⁷ . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии ²⁸ , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала. Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет мигание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода ²⁸ . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 ²⁸ , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения со сверхвысоким разрешением ²⁹ .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей ³⁰ .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода ³¹ представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатехуиновая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа ³² , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места для маркировки должны быть выбраны таким образом, чтобы расстояние между красителями изменялось с меньшего на большее, чем значение R ₀ (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET ³³ , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот ^{34, 35} . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители должны быть внутренне конъюгированы с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу ³⁶ , генетически кодируемую в геликазе Rep E.coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

Выход флуоресценции даже с приемлемым выходом белка был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза ^{37, 38} ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы ^{26, 39} .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Обнаружение одиночных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии ^{40, 41} создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для пар FRET, обсуждаемых здесь, и гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн могут быть добавлены для проверки наличия акцептора.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (размером ∼0,05 мм ² ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки — М, зеркальные; DM — дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения ПЗС. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается рядом на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).(b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид рамки на (а)). В PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ _c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под ^{40, 41} (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по закачке жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, производит ПВО на границе раздела стекло / вода ^{40, 41} (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

Микроскопия МДП приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых камер с электронно-умножением на заряженные пары (ЭМ-ПЗС) с передачей кадров ^{3, 42} . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые обладают высокой квантовой эффективностью (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низким эффективным шумом считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстродействием скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения таким образом, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров между каналами обнаружения возникают значительные перекрестные помехи (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность ⁴³ . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

В то время как кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин ^{5, 22, 44} .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин — менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (PEG) ⁴⁵ . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () ⁴⁴ (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом ⁴⁶ . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами ^{47, 48} . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с использованием хелатных групп Ni ²⁺ или Cu ^{2+ 49} , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидинового тега и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Yuji Ishitsuka, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифично связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).(b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвича с белком нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Поверхности, покрытые ПЭГ, могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni ²⁺ или Cu ²⁺ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри поверхностно-привязанных фосфолипидных везикул ^50-52 имитирует клеточный захват, уменьшает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков ⁵³ , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем наложения двусторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм ² ), препарат на предметном стекле считается приемлемым. После стрептавидина добавляют биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образцов изготавливается путем размещения предметного стекла микроскопа и покровного стекла двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с ^{исх. 7} с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в канал (ы) акцептора и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализованные донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (соответствующий площади ∼ 1 мкм ² ), интегрируются, чтобы восстановить интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы ⁵⁴ , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по кривым интенсивности после фотообесцвечивания) в обоих каналах кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E _app = I _A / ( I _A + I _D ), где I _A и I _D представляют интенсивности акцептора и донора соответственно.Приложение E предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ ² между двумя флуорофорами и необходимых инструментальных поправок. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ ² близка к 2/3 ^{34, 55} . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности регистрации между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI _A к изменению интенсивности донора, ΔI _D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI _A IΔI _Д ) ^{21, 56} .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около ^{57, 58} . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в окрестности ^59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей донора и акцептора), всего I , должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I _итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

3. Следует снимать длинные видеоролики, демонстрирующие одноэтапные события фотообесцвечивания, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) ⁶² — хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает только до уровня донора ( E _app = 0), считайте, что он мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии подавителей мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения ²⁸ .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о свойствах равновесия лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающей стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния ⁶³ , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстры для надежных определение времени пребывания ⁶⁴ .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки числа заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние ⁶⁵ (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных до конечных значений FRET для каждого перехода, полученный из HMM (или другого) анализа, обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных ^{57, 65-67} .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном ^68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный, визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом ⁷¹ .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода до того, как кто-то спроектирует первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК ^{72, 73} и многих белков ^{74, 75} .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной маркировке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R ₀ = 5 нм.Однако изменения расстояния всего лишь 0,3 нм могут быть обнаружены для одиночных молекул между 0,6 R ₀ и 1,5 R ₀ , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 ⁵ фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 ³ точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации ⁷⁶ , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями ^{77, 78} . Опасения по поводу этих проблем можно было бы дополнительно уменьшить, используя избыточное количество ограничений расстояния в исследованиях триангуляции ^{79, 80} .

Усовершенствованные методы smFRET

Ниже кратко излагаются некоторые из новых интересных технических разработок, которые все еще находятся на стадии подтверждения принципа.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения неоднозначности. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных ⁴³ .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами ^{81, 82} . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц ^{83, 84} недавно была расширена до трехцветной FRET ⁸⁵ .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК ⁸⁶ .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расшифровки флуоресценции одиночных молекул ⁸⁷ и FRET ⁸⁸ , чтобы сообщить о распаковке шпильки ДНК, вызванной силой.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК ⁸⁹ . Совсем недавно отклик одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживался с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складывающегося ландшафта ⁹⁰ . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина ^{91, 92} .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы по хорошо зарекомендовавшей себя системе smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще не разработаны, — это измерения в живой клетке, что, вероятно, требует значительных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть глаза «одной молекуле» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования полиэтиленгликоля (PEG 9000) поверхности

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждения, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальными институтами здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

Black Fret Artist — обладательница крупного гранта 2016 Венди Колонна

Выступление на Black Fret Black Ball 2016

10 декабря мне выпала честь быть среди 10 артистов из Остина, получивших грант в размере 17 000 долларов США от Black Fret, потрясающая музыкальная некоммерческая организация из Остина, финансируемая спонсорами.Еще 10 художников, которые были номинантами в 2016 году, также были награждены 5000 долларов и имеют право на вторую номинацию в 2017 году. В 2016 году номинантами были Bee Caves, Карсон МакХоун, Дэн Дайер, Накия, Рэй Прим, Сюзанна Чоффель, «Плавание с медведями», The Peterson Brothers. , Walker Lukens, Brownout, Calliope Musicals, Dana Falconberry, Daniel Eyes & The Vibes, Golden Dawn Arkestra, Harvest Thieves, Leopold and His Fiction, Magna Carda, Sweet Spirit и The Name Sayers.

Святая корова.

После 20 лет работы в этом бизнесе, 17 лет в Остине и множества взлетов и падений в моей карьере, я просто потрясен. Во-первых, когда я подписал контракт в 19 лет, бизнес строился на рекордных продажах в качестве финансовой основы. Это ушел по пути дронта. Музыка бесплатна, но по-прежнему требует больших затрат в производстве и еще более затратных для продажи.

Поскольку записанная музыка упала в денежном выражении, артисты, подобные мне, проводят много времени в турах, продавая другие товары и впечатления (например, кампания на моей странице PledgeMusic, созданная для финансирования выпуска моего нового альбома в апреле 2017 года).Мы также в конечном итоге реинвестируем около 65-70% нашего дохода в наш бизнес, чтобы поддерживать работу. Мы срезали углы, как будто я два года был без дома, или жил в фургоне, или с полудюжиной соседей по комнате. Мы заставляем это работать.

Получение гранта на Black Fret Black Ball 2016

Хотя я гастролировал 20 лет и у меня было много удивительных и значимых возможностей для роста и поддержания себя как артиста, я также не видел ни одного из этих фантастических «Разрывы», о которых говорят люди.На протяжении многих лет я получал бесчисленное количество сообщений и слышал от тысяч поклонников, которые от всего сердца делятся тем, что музыка обогащает их жизнь. Это заставило меня пережить самые тяжелые времена. Хотя мой последний альбом Nectar и реклама Coca-Cola, которую я написал, открыли мою музыку для многих новых людей, у нас была большая пресса, в следующем году я не стал значительно богаче. Может быть, такие причудливые, мифические «перерывы» тоже остались в прошлом. Многие из моих друзей, у которых были контракты с мейджор-лейблами, были замечены на певческих реалити-шоу и даже у таких музыкантов, как Def Leppard, Macy Grey и Melissa Etheridge, которые выиграли ОГРОМНУЮ Грэмми, проводят краудфандинговые кампании PledgeMusic, как маленький старый я.

Понятие свободы музыки для потребителей одинаково для всех нас.

Несмотря на цифры, мы все должны выглядеть привлекательно для публики, чтобы чувствовать, что мы делаем что-то необычное. Но большинство из нас, в том числе перечисленные выше великие люди, смотрят на аналогичные цифры и задаются вопросом, как мы сможем позволить своей следующей песне тронуть сердца слушателей или добраться до следующего города и покрыть гостиничные номера, производство и маркетинг.

И мы все еще делаем все возможное для музыки.

2016 Black Fret

Black Fret предлагает нечто иное. Участники номинируют музыкантов, которые охватывают все жанры — людей, играющих все, от хард-рока до хип-хопа, соула и блюза, до авторов-исполнителей и безумно оркестрованного психоделического рока с гимном. Они любят музыку. Они посещают шоу, которые курирует сообщество в течение года, и голосуют за своих фаворитов, чтобы получить грант за их тяжелую работу и музыкальное мастерство. Они гордятся своими группами, которые продолжают делать удивительные вещи на свои гранты.

Группы, получившие гранты, покупают более безопасные туристические фургоны, они снимают музыкальные клипы, нанимают публицистов, они совершают поездку по новым местам с меньшим риском, они могут легче дышать и время от времени спать в отеле в дороге (вместо своих фургон или фан-кушетка напольная). Их карьера заметно улучшается благодаря грантам, большим и малым.

Гранты не выдаются отобранным артистам единовременно. Black Fret считает, что выбранные ими артисты обогатят их карьеру, «разблокируя» их гранты в рассрочку.Следующий год своей карьеры я потрачу на постепенное получение гранта путем выполнения, записи, написания и выполнения работ по оказанию помощи другим некоммерческим организациям. Каждая из этих задач открывает определенную сумму в долларах.

Кроме того, номинанты и получатели грантов имеют доступ к сообществу профессионалов музыкального бизнеса, которые будут сидеть с ними и помогать им разрабатывать стратегии, позволяющие разумно распоряжаться своим временем, деньгами и талантами. Среди этих профессионалов — производители, инженеры мирового класса, публицисты, специалисты по лицензированию, агенты по бронированию, юристы и многие другие.Этот консультативный совет УДИВИТЕЛЬНЫЙ. За последние шесть месяцев я встретился примерно с 16 из 38 консультантов, и мне очень понравилась каждая минута времени, которое я потратил на обучение у них.

Black Fret готов расшириться до других городов. Следующими они ищут Денвер и Нэшвилл. Ага!

Лично я чертовски взволнован.

Хотите узнать больше об этой удивительной организации? Хочу присоединиться? Хотите привнести Black Fret в свой музыкальный город? Посетите их новый крутой сайт www.blackfret.org, чтобы узнать больше!

Вот статья из Forbes о Black Fret.

Вот замечательная статья в Austin Chronicle о многих некоммерческих организациях Остина, связанных с прекрасной музыкой!

Вот статья, недавно написанная журналом Pitchfork Magazine, в которой более подробно описывается домен .org.

Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist

Обзор Black Fret | Музыкальный журнал Lone Star

Ричард Сканс

(LSM июль / август 2014 г. / том 7 — выпуск 4)

Раннее воскресенье — например, раньше полудня — может показаться странным временем для созыва собрания музыкальных исполнителей и профессионалов.Но тот факт, что некоторые из самых известных и опытных закулисных музыкантов Остина и многие из самых ярких и многообещающих талантов собрались утром 22 июня в доме Колина Кендрика, основателя группы non -прибыльный Black Fret был свидетельством того, насколько все они верят в дело сохранения наследия Остина как одного из лучших музыкальных городов в мире.

Дэвис Макларти и Дэнни Мэлоун (Фото Эми Прайс)

«Миссия Black Fret — помочь нашим музыкантам создавать и исполнять отличную новую музыку», — объясняет Кендрик, адаптировавший модель Black Fret из вековой традиции меценатства частным искусствам.Каждый год общественная благотворительная организация будет предоставлять гранты в размере 10 000 долларов 10 различным музыкальным артистам или группам Остина по выбору покровителей, которые приобрели членство в Black Fret на 1 500 долларов. Члены также голосуют за первых 20 номинантов, участвующих в конкурсе на получение грантов, и могут посещать частные концерты и другие мероприятия Black Fret в течение года. Тем временем всем кандидатам на гранты разрешается назначать встречи наставников / подопечных с консультативным советом Black Fret, выдающимся сообществом профессионалов отрасли, включая продюсеров, владельцев студий, менеджеров, агентов по бронированию, промоутеров на радио и юристов в сфере развлечений.

Хизер Вагнер-Рид с Доун и Хоукс (фото Эми Прайс)

Цель воскресного собрания в июне состояла в том, чтобы позволить артистам, номинированным в этом году, — Эми Кук, Дэнни Мэлоун, Dawn & Hawkes, East Cameron Folkcore, Элиасу Хаслангеру и Черчу в понедельник, Элизабет МакКуин, Эмили Белл, Эрин Айви, Джине. Чавес, Грэм Уилкинсон, Джиттербаг Гадюки, Джонни Грей, Линкольн Дарем, Литтл Радар, Мать Сокол, Тихая компания, Ракетные парни, Сестры Виски, Дикий ребенок и Зил — возможность представиться консультативному совету.Артисты и «наставники» общались друг с другом один на один по несколько минут, «в стиле скоростных свиданий», а затем по очереди менялись, чтобы у всех была возможность встретиться.

«Это был первый раз, когда все наставники собрались вместе с группой», — сказала член консультативного совета Хизер Вагнер Рид, президент и основатель Juice Consulting, находящейся в Остине фирмы по связям с общественностью, маркетингу и развитию артистов. «Я не знаю, знал ли кто-нибудь, чего ожидать, но после этого мы все были потрясены.Было просто вдохновляюще видеть энергию в комнате и то, какое взаимодействие эти художники и консультанты имели вместе ».

Помимо Вагнера Рида, остальные из только что объявленных членов консультативного совета Black Fret (не все из которых смогли присутствовать на первоначальной встрече и приветствии): Марк Аддисон, Роджи Баер, Майк Кроули, Си Джей Эйркссон, Дженни Финли, Уилл Хоффман, Террани Джонсон, Терри Ликона, Уэстон Макгоуэн, Дэвис Макларти, Мэтт Новески, Тим Палмер, Питер Шварц, Карлос Соса, Джо Сталлоне, Стюарт Салливан, Майк Суинфорд, Кевин Уоммак и Том Вейл.

В дальнейшем художники и члены консультативного совета будут организовывать дополнительные встречи наставников друг с другом, если это позволяет их график. У номинантов также будет возможность выступать перед участниками Black Fret на регулярных мероприятиях в течение остальной части летнего и осеннего «периода прослушивания». Все это приводит к первому ежегодному Черному балу, на котором будут объявлены 10 победителей гранта. Гала-концерт состоится в ноябре, место и дата проведения будут объявлены дополнительно.

После сбора 1 доллара.75M для музыкантов из Остина, Black Fret надеется сохранить музыку в Сиэтле.

Лондон называет нынешнюю ситуацию «идеальным экономическим штормом», который произошел из-за того, что рост стоимости жизни в Сиэтле начался одновременно с «демонетизацией музыки». . » Тенденция к «бесплатному» стримингу обходится дорого, и даже живые выступления не меняют разницы. Лондон играл в группах Сиэтла последние три десятилетия, в том числе в Alcohol Funnycar и Stag, но, по его словам, популярность в местных клубах не выросла.«Чтобы увидеть большинство местных групп в клубах Сиэтла в течение 25 лет, нужно было 8 долларов, — говорит он.

Эд Бисон тоже знает эту математику, как бывший владелец клуба (Backstage в Балларде), менеджер группы, а теперь и Gigs4U, который доставляет музыку в международный аэропорт Сиэтл-Такома и другие места в Сиэтле. «Модель финансирования Black Fret будет иметь большое значение для начинающих художников», — говорит Бисон. «Но я также думаю, что существует большая потребность в местной ассоциации музыкального бизнеса, которая могла бы обслуживать музыкантов и такие предприятия, как студии, концертные площадки, розничных продавцов и преподавателей.Это действительно проблема экономического развития ».

Отчет за 2016 год показал, что музыкальная экономика Сиэтла — это индустрия с оборотом 1,8 миллиарда долларов, в которой непосредственно занято более 16 000 человек. И все же средний доход работающих музыкантов в Сиэтле составляет 15 000 долларов в год. (Средний доход среднего работника в районе Сиэтла составлял 49 618 долларов в 2018 г.)

Шумиха вокруг Грэмми, вероятно, поднимет национальную прессу о том, что доходы от музыки в целом растут после десятилетий спада — общие продажи записанной музыки выросли на 10% в 2018 году , а виниловые диски сейчас продаются больше, чем компакт-диски.Но эти цифры не принимают во внимание тот факт, что даже когда вы транслируете мощный хит Брэнди Карлайл «Шутка», Spotify или YouTube сначала платят звукозаписывающим компаниям или музыкальным издателям, прежде чем что-либо достанется музыкантам. В прошлом месяце автор песен из Нэшвилла Десмонд Чайлд сообщил, что его вырезка из половины миллиардов стримов за последний год мегахита «Livin ‘on a Prayer», написанного им в соавторстве с Бон Джови, стоила всего 6000 долларов.

Эта некоммерческая организация в Остине меняет способ оплаты труда местных музыкантов

Зимой 2012 года Мэтт Отт и Колин Кендрик собрались на заднем дворе Южного Остина с несколькими местными музыкантами и задали простой вопрос: какие ресурсы действительно изменят игру для городской цитадели начинающих художников? Хотя коренные остинцы и друзья детства сами не музыканты (Отт работает в компании-разработчике программного обеспечения Personify, Кендрик — в компании SunPower, занимающейся солнечной энергией), они десятилетиями участвовали в местной музыкальной жизни, основав (вместе с Никки) Роулинг) Музыкальный фонд Остина десятью годами ранее.

«Это был просто откровенный разговор о том, где каждый из нас был», — вспоминает певица и автор песен Джина Чавес. «Кому-то нужен туристический фургон, кому-то нужна реклама, кому-то нужно оборудование — от 10 до 20 тысяч долларов — вот такие цифры, о которых говорят».

В результате этого собрания и бесчисленных подобных разговоров в конечном итоге возникла Black Fret, общественная благотворительная организация 501 (c) (3), которая все больше и больше вызывает волну в музыкальном сообществе Остина из-за того, как она поддерживает местные таланты.Всего за несколько коротких лет Black Fret передали более 280 000 долларов напрямую артистам Остина, в том числе восходящим звездам Шеки Грейвс, Дане Фалконберри и Wild Child. Позже на этой неделе, на своем ежегодном Черном балу, организация объявит о грантах на сумму более 200 000 долларов — более 5000 долларов для малых грантов и 10 000 долларов для крупных, — которые Black Fret предоставит более чем дюжине местных музыкантов в течение 2017 года. доступ к сети консультантов — большой плюс для города, который, хотя и известен как мировая столица живой музыки, «не имеет инфраструктуры музыкальной индустрии профессионального уровня», — говорит Чавес.

То, как эти артисты собирают гранты, является частью того, что отличает организацию от других и, как надеются Отт и Кендрик, будущей моделью для других центров живой музыки по всей Америке. Музыканты должны «разблокировать» его через ряд этапов карьеры: гастроли за пределами Остина (каждое выступление приносит им 250 долларов), запись музыки (1000 долларов за песню, которые постепенно награждаются на протяжении всего процесса написания и записи) и игры для других местных некоммерческих организаций (1000 долларов США). ).

Откуда берутся эти деньги, перекликается с давно установившейся системой патронажа изобразительного искусства, когда 350 покровителей Black Fret платят ежегодный членский взнос в размере 1500 долларов.Взамен они могут посещать местные шоу с участием артистов Black Fret. «Музыка заслуживает поддержки общества, так же как опера, симфония и балет поддерживались на протяжении сотен лет», — говорит Отт.

«Когда я услышал, что некоторые группы в городе получают гранты в год, когда он начался, я подумал, что каким-то волшебным образом город решил предоставить гранты», — говорит Сабрина Эллис, чья хриплая группа Sweet Spirit из девяти человек получит грант на этом мероприятии. черный шар года. «Это действительно хорошо для пожилых, более стабильных в финансовом отношении людей.Деньги определенно поступают от желания финансировать музыку и немного повеселиться ».

В Остине, конечно же, есть и другие некоммерческие организации, занимающиеся музыкой, от заботящихся о здоровье (SIMS Foundation для служб психического здоровья музыкантов, Health Alliance for Austin Musicians) до более общей поддержки (Austin Music People, Ott and Собственный Austin Music Foundation Кендрика). Но это не меняет того факта, что, согласно опросу 2380 местных музыкантов, проведенному городом в 2015 году, 20 процентов музыкантов в Остине живут за чертой бедности, а 30 процентов — чуть выше нее.Многие из музыкантов Black Fret, с которыми я разговаривал, ссылались на повседневную работу, а также на проблемы, возникающие из-за двойного — и часто противоречивого — стремления творить искусство и зарабатывать на жизнь в быстро развивающемся городе.

Связывание флуоресцентного лиганда с временным разрешением для рецепторов, связанных с G-белком.