Лада гранта метки грм: Замена ГРМ Лада Гранта 8 клапанов, схема и метки ГРМ

Содержание

Замена ГРМ Лада Гранта 8 клапанов, схема и метки ГРМ

Замена ГРМ Лада Гранта 8 клапанов требуется раз в 75 тысяч километров пробега. Если игнорировать плановую замену ремня, натяжного ролика и иногда помпы (насоса охлаждающей жидкости), то можно нарватся на серьезный ремонт двигателя Lada Granta. Ведь обрыв ремня газораспределительного механизма практически всегда приводит к повреждению клапанов, седел клапанов и даже поршней. Поэтому к приводу ГРМ нужно относится очень внимательно. Раз 15 тысяч необходимо обязательно осматривать ремень на предмет разрывов, трещин, отслоений или замасливания.

Подробная схема привода ГРМ Лада Гранта далее.

  • 1 — зубчатый шкив коленчатого вала
  • 2 — зубчатый шкив насоса охлаждающей жидкости
  • 3 — натяжной ролик
  • 4 — задняя защитная крышка
  • 5 — зубчатый шкив распределительного вала
  • 6 — зубчатый ремень ГРМ
  • А — прилив на задней защитной крышке
  • В — метка на шкиве распределительного вала
  • С — метка на крышке масляного насоса
  • D — метка на шкиве коленчатого вала.

Для замены ремня привода газораспределительного механизма нам следует демонтировать ремень привода генератора или ремень привода вспомогательных агрегатов для Гранта с кондиционером. Шестигранником «на 5» отворачиваем четыре винта крепления передней верхней крышки привода ГРМ и снимаем пластиковый кожух.

Во избежание повреждения датчика положения коленчатого вала необходимо снять и его. При выключенном зажигании отжимаем фиксатор колодки жгута проводов и отсоединяем колодку от разъема датчика. Головкой «на 10» отворачиваем болт крепления датчика.

Вынимаем датчик из отверстия прилива крышки масляного насоса и откладываем его на место, где нет стальных опилок, могущих впоследствии нарушить работу датчика.

Перед демонтажем ремня необходимо проверить фазы газораспределения двигателя — установить поршень 1-го цилиндра в положение ВМТ (верхней мертвой точки) такта сжатия. Головкой «на 17» проворачиваем коленчатый вал по часовой стрелке за болт крепления шкива привода генератора до момента совмещения метки 1 на зубчатом шкиве распределительного вала с приливом 2 на задней крышке привода ГРМ.

Чтобы убедиться в правильном положении коленчатого вала, вынимаем резиновую заглушку смотрового окна в верхней части картера сцепления. Риска 2 на маховике должна располагаться напротив прорези 1 шкалы которая видна в окне крышки картера сцепления.

Перед отворачиванием болта крепления шкива привода генератора просим помощника зафиксировать коленчатый вал от проворачивания, вставив через окно в картере сцепления отвертку между зубьями маховика.

Головкой «на 17» отворачиваем болт крепления шкива привода генератора снимаем шкив и шайбу.

Шестигранником «на 5» отворачиваем три винта крепления передней нижней крышки привода ГРМ. Снимаем крышку.

Накидным ключом «на 15» ослабляем затяжку болта крепления натяжного ролика.

При этом натяжной ролик повернется и натяжение ремня ослабнет. Снимаем ремень привода ГРМ со шкивов коленчатого и распределительного валов. Вынимаем ремень из моторного отсека Гранты.

Внимание! После снятия ремня привода ГРМ нельзя проворачивать коленчатый и распределительный валы во избежание утыкания поршней в клапаны. Размеры зубчатого ремня привода ГРМ Lada Granta с двигателем 8 клапанов — ширина 17 мм, число зубьев 113.

Для снятия натяжного ролика ремня ГРМ отворачиваем болт его крепления и снимаем натяжной ролик вместе с болтом.

Вращаем пластмассовую обойму ролика, удерживая его за эксцентрик. Ролик должен вращаться бесшумно, равномерно и без заеданий. В противном случае ролик необходимо заменить.

Заодно можно проверить исправность насоса охлаждающей жидкости, покрутив и покачав его за шкив. Устанавливаем натяжной ролик на место, окончательно не затягивая болт его крепления. Для разных модификаций двигателя в головке блока цилиндров выполнены два резьбовых отверстия под болт крепления натяжного ролика. Болт крепления ролика вворачиваем в верхнее отверстие головки блока цилиндров. На фото ниже отверстие обозначено красной стрелкой.

Устанавливаем ремень привода ГРМ Гранта в обратной последовательности. Перед установкой ремня убеждаемся в совмещении установочных меток коленчатого и распределительного валов. Надеваем ремень на зубчатый шкив коленчатого вала, затем натягивая обе ветви ремня, надеваем заднюю ветвь на шкив насоса охлаждающей жидкости и заводим ее за натяжной ролик, а переднюю — надеваем на шкив распределительного вала.

При необходимости доворачиваем шкив распределительного вала в сторону наименьшего хода до совпадения зубьев ремня с впадинами шкива. Для натяжения ремня необходимо повернуть натяжной ролик против часовой стрелки. Для этого вставляем в пазы наружного диска ролика стержни (диаметр 4 мм, расстояние между стержнями 18 мм) специального ключа (для наглядности показано на снятом ролике).

Такой ключ использовался при регулировке натяжения ремня во всех переднеприводных ВАЗах, купить его можно в любом магазине автозапчастей.

Также для регулировки натяжения ремня ГРМ Лада Гранта можно использовать щипцы для снятия стопорных колец. Натягиваем ремень, поворачивая натяжной ролик ремня против часовой стрелки до момента совпадения выреза наружного диска ролика с прямоугольным выступом его внутренней втулки, и затягиваем болт крепления ролика моментом 34–41 Нм.

Чрезмерное натяжение ремня снижает срок его службы, а также срок службы подшипников насоса охлаждающей жидкости и натяжного ролика. Недостаточное натяжение ремня тоже приводит к его преждевременному выходу из строя и может вызвать нарушение фаз газораспределения. Проворачиваем коленчатый вал на два оборота по часовой стрелке. Проверяем натяжение ремня и совпадение установочных меток коленчатого и распределительного валов. При снятом шкиве привода генератора правильное положение коленчатого вала удобно контролировать по совмещению метки 1 на зубчатом шкиве коленчатого вала с ребром 2 крышки масляного насоса. Фото для наглядности далее.

Если в не уверены в своих силах, то можете доверить работу по замене ремня на Лада Гранта автосервису. Для двигателя с 8-клапанным механизмом ГРМ это выходит дешевле, чем для версии с 16 клапанным мотором.

Замена ремня ГРМ Лада Гранта с двигателем 8 клапанов 87 л.с пошаговая инструкция

На чтение 4 мин. Опубликовано

20.09.2020

Сегодня к нам приехал наш старый клиент на своей белой Ладе Гранта, замена ремня ГРМ, ролика и помпы в месте с антифризом. С завода на этом моторе устанавливается ремень ГРМ фирмы Gates с заявленным ресурсом 75 тысяч километров, но меняем на 60 на всякий случай.

Важно! При обрыве ремня ГРМ на данном двигателе гнет все клапана. Это справедливо для всех моторов выпуска до 2019 года.

Недавно я прочитал, что с 2019 года на данном двигателе стали ставить безвтыковые поршни, как приедет свежая Гранта обязательно поглядим эндоскопом так ли это.

Необходимый инструмент

Нам понадобится стандартный набор ключей и головок, шестигранник на 5, а так же ключ для натяжного ролика.

Подготовительные операции

Данную процедуру можно провести даже в полевых условиях, яма а уж тем более подъемник нам не потребуется. Время замены 30 минут, без учета времени остывания двигателя.

Если вы меняете с ремнем и помпу, то необходимо слить антифриз с блока цилиндров. Заглушка под головку на 13. Подкладываем под заднее колесо упоры и затягиваем ручник. Снимаем переднее правое колесо и пластиковый брызговик.

Ослабляем натяжение ремня генератора и снимаем ремень. Гайка на 21 контрящая, шток натяжного ролика под ключ на 10. Покрутите натяжной ролик, если он издает посторонний шум, замените его.

Натяжитель ремня генератора.

Откручиваем четыре болта верхней крышки ГРМ и снимаем ее (шестигранник на 5).

Верхняя крышка ГРМ.

Выставляем верхнею мертвую точку

За болт шкива коленвала, обязательно по часовой стрелки, проворачиваем его до совпадения меток на звездочке распредвала и кожухе (головка на 17 с удлинителем). Это будет верхняя мертвая точка (ВМТ).

Шкив коленвала.Метки на распредвале.

Стопорим коленвал, включаем пятую передачу и вставляем отвертку в вентиляционный канал тормозного диска ниже суппорта. Откручиваем болт шкива коленвала и снимаем шкив. Откручиваем крепление нижней крышки ремня ГРМ (шестигранник на 5).

Нижняя крышка.

На звездочке коленвала метка должна встать на против отлива на масляном насосе.

Метки на коленвале.

Откручиваем крепление натяжного ролика и снимаем его вместе с ремнем ГРМ.

Если вы не меняете помпу то переходите сразу к установке нового ремня. Но мы рекомендуем менять помпу вместе с ремнем.

Замена помпы

Демонтируем звездочку распредвала (головка на 17).

Крепление звездочки распредвала.

Далее кожух ремня ГРМ (гайка и болты на 10).

Кожух.

Помпа крепится тремя болтами (шестигранник на 5).

Крепление помпы.

Перед установкой новой помпы смажьте прокладку тонким слоем герметика. Установите на место кожух и звездочку распредвала.

Установка нового ремня ГРМ

Достаем свежи купленный комплект.

Комплект ГРМ.

Важно! На натяжном ролике ремня ГРМ указано направление натяжки, не перепутайте.

Направление натяжки.

Проверяем совпадение всех меток и устанавливаем натяжной ролик, болт не затягиваем. Устанавливаем новый ремень ГРМ сначала на звездочку коленчатого вала, за тем распредвала, натяжной ролик и помпу. Ветвь ремня между звездочками распредвала и коленвала должна быть натянута. Натягиваем натяжной ролик до совпадения меток и затягиваем болт.

Правильная натяжка.

Еще раз проверяем совпадение меток, после чего проворачиваем коленвал два оборота и проверяем натяжку. Если натяжение ослабло подтягиваем.

Установленный ремень.

Устанавливаем все детали в порядке обратном снятию. Заливаем антифриз. Вот и всё! Кстати двигатель идентичен устанавливавшемуся на Калины второго поколения, про замену ГРМ на них описано в этой статье.

Удачи на дорогах. Ни гвоздя, ни жезла.

Меняем ремень ГРМ на 8-клапанных моторах своими руками: фото и видео

Согласно регламенту, производить замену ремня ГРМ нужно каждые 75 000 км. Совет относится к двигателям ВАЗ-11183, 11186 и 21116. Все они являются 8-клапанными и устанавливаются в автомобили «Гранта». Рассмотрим действия по замене.

Подготовительные операции, все двигатели

Во-первых, запомните простое правило: мотор 11183 не может погнуть свои клапаны, так что вращать коленвал и шкив распредвала можно будет по-отдельности.

Для моторов 11186 и 21116 это было бы недопустимо! Подробнее о двигателе 21116 в этом материале.

Перед проведением любых работ отключите клемму АКБ (ключ на 10), а также датчик ДПКВ. Но прежде надо снять защитную крышку.

Откручиваем 4 болтика, снимаем защиту

Для снятия защиты нужно:

  • 11186/21116 – используя «внутренний шестигранник на 5», откручивают 4 болта на верхней детали, которую затем снимают. И так же демонтируют нижнюю деталь;
  • 11183 – гаечным ключом «на 10» откручивают 3 болта крепления.

Справиться с тем, что сказано выше, будет несложно.

Отключаем разъём, выкручиваем один винт

Датчик положения коленвала (ДПКВ) отключают от разъёма (см. фото). Затем крепёжный винт выкручивают ключом «на 10». Сам датчик нужно демонтировать.

Установка всех валов по меткам

Сначала проверьте, что включена нейтральная передача. На корпусе картера ближе к узлу сцепления есть резиновая крышка. Её нужно снять.

Смотровое окно и резиновая заглушка

Смысл в том, чтобы добиться совмещения рисок на маховике и в прорези шкалы.

Когда это будет выполнено, маховик фиксируют отвёрткой.

Маховик зафиксирован

Конечно, подобную операцию проще выполнять вдвоём. Знайте, что нужному положению вала соответствует совмещение меток A-B и C-D (см. рис.).

Привод ГРМ в 8-клапанных моторах

Сам коленвал нужно вращать вправо, используя ключ «на 17» или «на 19» (мотор 11183). Смысл сказанного иллюстрируется на фото.

Крутить нужно шкив привода генератора

Ремень генератора надо снять

Генераторный ремень закрывает доступ к деталям привода ГРМ. Придётся ослабить крепление и снять этот ремень.

Подробнее об этом:

Крепление генератора, болты на 13

Ключом «на 13» ослабляют нижний болт крепления. Затем выкручивают верхнюю крепёжную гайку и вынимают болт. Кожух генератора прижимают к двигателю и фиксируют конструкцию проволокой. Теперь ремень можно удалить.

Монтаж генераторного ремня проводят в такой последовательности:

  1. Закрепляют генератор;
  2. Накидывают ремень на шкивы, как показано на фото;

    Монтаж ремня генератора, первый шаг

  3. Включив 5-ю передачу, откатывают автомобиль назад.

Знайте, что повторное использование ремня генератора – это крайняя мера. Лучше будет купить новую деталь.

Замена ремня привода ГРМ

Пусть маховик двигателя был правильно установлен и зафиксирован (см. выше). Тогда ключом «на 17» или «на 19» (ДВС 11183) откручивают винт, удерживающий шкив привода генератора. Сам шкив и защитную шайбу затем снимают.

Шкив не должен мешать

Теперь нужно ослабить прижимную силу в натяжном ролике:

  • 11186/21116 – используя «круглый» ключ «на 15», откручивают болт крепления на 2-3 оборота. Ролик «отпустит» ремень автоматически;

    Автоматика сработает на ослабление

  • 11183 – ключом «на 17» нужно ослабить гайку крепления. Затем сам ролик вращают по часовой стрелке.

Осталось выполнить замену: на место старого ремня ГРМ устанавливают новую деталь, и всё. Монтаж остальных деталей производят в обратном порядке.

Основная операция по замене

Чтобы повысить прижимную силу, внешний узел ролика вращают против часовой стрелки. Для двигателей 11186/21116 нужно выполнить дополнительное требование: две прямоугольные метки должны совпасть.

Обязательное требование для моторов 11186/21116

По завершению монтажа метки A-B и C-D тоже должны совпадать. Чертёж для них приводится выше.

Моменты затяжки

Чтобы выполнить монтаж правильно, нужен ключ с регулятором усилия. Значение на нём выставляют в зависимости от вида детали:

  • Винт крепления натяжного ролика (11186/21116) – 17-27 Н*м;
  • Крепёжная гайка ролика (11183) – 30–36 Н*м;
  • Крепёж шкива генератора – 105–110 Н*м.

Сначала на ролике настраивают натяжение, а затем производят затяжку крепежной гайки или болта.

Детали из вазовского каталога

Сразу рассмотрим список узлов и специнструмента ВАЗ:

  • Натяжной ролик для ДВС 11183 – 2108-1006120, гайка для него – 00001-0021647-21;
  • Ремень ГРМ (11183) – 2108-1006040-10;
  • Автоматический натяжной ролик – 21116-1006226;
  • Ремень ГРМ (11186/21116) – 21116-1006040;
  • Ключ для автоматического ролика – 67. 7812.9573-01;
  • Ключ для ролика ВАЗ-11183 – 67.7834.9525.

Натяжной ролик семейства «2108» имеет две прорези на одной стороне. Эти прорези должны смотреть «вверх», то есть в сторону «от двигателя».

Натяжной ролик для мотора 11183

Прорези были сделаны под специнструмент. Он обозначается цифрами «67.7834.9525» (см. список). А для автоматических роликов ключ обозначается по-другому – «67.7812.9573». Как он выглядит, показано ниже.

Ролик-автомат тоже можно регулировать

Осталось перечислить, как обозначены крепёжные болтики, шайбы и так далее:

  • Три болтика для крышки ВАЗ-11183 – 00001-0009024-11, шайбы – 00001-0026406-01;
  • Крышка привода ГРМ (11183) – 21080-1006146-10;
  • Болтики от крышек ВАЗ-21116 – 2108-1003286-00, шайбы пружинные – 00001-0011977-73;
  • Верхняя крышка – 21116-1006226-00, нижняя крышка – 21116-1006218-00.

Надеемся, вопросов здесь не возникнет.

Импортные аналоги

Для замены ремней «2108-1006040-10» подходят разные комплектующие:

  • GATES – 5521 или 5521XS;
  • BOSCH – 1 987 949 095;
  • DAYCO – 94089;
  • CONTITECH – CT527;
  • Finwhale – 2108-1006040.

Ремень ГРМ «21116-1006040» можно заменить другой деталью:

  • GATES – 5670XS;
  • CONTITECH – CT1164;
  • QUARTZ (Германия) – QZ-5670XS.

Обычно выбор делают в пользу продукции GATES. Буквы «XS» в её каталоге означают «усиленный». Подробно о сроках замены ремня ГРМ, о его выборе, о признаках износа нам уже рассказали Грантоводы в материале: когда менять ремень ГРМ на Гранте: рекомендации завода и грантоводов.

Оригинальный ремень ГРМ и подделка

Внимание! Комплектующие фирмы GATES (Англия) подделывают чаще всего! По фото можно понять, в чём состоит главное отличие. Остерегайтесь подделок.

Поясняющее видео о том, где искать метки

Замена ремня ГРМ на автомобилях Лада с двигателем 16 клапанов

В настоящее время все новые Лада Приора выпускается с 16 клапанными двигателями. Эти силовые агрегаты также устанавливаются и на некоторые комплектации автомобилей Лада Гранта, Калина, Веста или XRAY. Газораспределительный механизм (ГРМ) этих двигателей предназначен для своевременного впуска в цилиндры двигателя горючей смеси и выпуска отработавших газов. Важно регулярно проверять состояние его ремня и при необходимости выполнить замену.

ЧЕРЕЗ СКОЛЬКО НУЖНО МЕНЯТЬ РЕМЕНЬ ГРМ
Согласно регламенту ТО Лада Приора, проверку состояния ремня ГРМ следует проводить через 105 тыс. км, а замену — через 200 тыс. км пробега. Однако срез зубьев или обрыв ремня ГРМ может привести к утыканию клапанов (гнет клапана) в поршни, что приводит к дорогостоящему ремонту двигателя. Поэтому рекомендуем проверять состояние ремня ГРМ чаще — через каждые 45 тыс. км пробега.
На автомобилях Лада Гранта и Лада Калина 2 проверка ремня ГРМ выполняют каждое ТО (каждые 15 000 км. пробега), а замену производят через 75 тыс. км. пробега.
СНЯТИЕ РЕМНЯ ГРМ
Потребуется: шестигранник «на 5», головка «на 17», «на 15», «на 10» и большая плоская отвертка.

Порядок действий:


Ослабить натяжение ремня, провернув болт ролика.

Снять ремень со шкивов распредвалов натяжного и опорного роликов.

После снятия ремня ГРМ коленвал и распредвал поворачивать нельзя. При замене ремня ГРМ также меняются натяжной и опорный ролики ремня.

УСТАНОВКА РЕМНЯ ГРМ
Перед установкой роликов следует на резьбовую часть нанести резьбовой герметик. Болт натяжного ролика окончательно не затягиваем. Перед установкой ремня ГРМ проверяем совмещение установочных меток. Положение коленвала удобно контролировать по совмещению метки 1 на зубчатом шкиве коленвала с меткой 2 (ребро) на крышке масляного насоса.

Надеваем ремень ГРМ на шкив коленвала, натягивая обе ветви ремня, заводим переднюю ветвь за опорный ролик, а заднюю, надев на шкив насоса охлаждающей жидкости, — за натяжной ролик. Затем надеваем ремень ГРМ на шкивы распредвалов.

КАК НАТЯНУТЬ РЕМЕНЬ ГРМ

  • Вставить наконечники щипцов для снятия стопорных колец в пазы наружной обоймы натяжного ролика.
  • Натянуть ремень, поворачивая натяжной ролик против часовой стрелки.
  • Совмещаем вырез 1 наружной обоймы ролика с прямоугольным выступом 2 его внутренней втулки. Затягиваем ключом болт крепления ролика.

    После установки шкива привода генератора, поворачиваем коленвал за болт крепления шкива на два оборота по часовой стрелке. Проверяем совмещение установочных меток на коленвале и распредвале, а также совмещение выреза с выступом на натяжном ролике.

Замена ремня ГРМ на автомобилях Лада с двигателем 8 клапанов

АвтоВАЗ комплектует современные автомобили Лада (Гранта, Калина, Приора, Веста и Ларгус) двигателями различной мощности, среди них есть, как 16 клапанные, так и 8 клапанные силовые агрегаты (например, моторы ВАЗ-11183, ВАЗ-11184, ВАЗ-11186, ВАЗ-11189, ВАЗ-21116). В статье покажем, как поменять ремень газораспределительного механизма на двигателе 8 клапанов.

ЧЕРЕЗ СКОЛЬКО НУЖНО МЕНЯТЬ РЕМЕНЬ ГРМ
Чтобы исключить обрыв ремня ГРМ, завод-изготовитель рекомендует каждое ТО (каждые 15 тыс. км. пробега) выполнять проверку ремня. А замену производить через 75 тыс. км. пробега.

СНЯТИЕ РЕМНЯ ГРМ
Потребуется: снять ремень генератора, правое колесо и пластиковый щиток моторного отсека, приготовить ключ "на 10", "на 17", головку "на 19", отвертку.

Порядок действий:

  • Снять пластиковый кожух двигателя.
  • Снять защитную крышку привода ГРМ, вывернув три болта крепления.
  • Схема ГРМ.

    Установить поршень первого цилиндра в положение верхней мертвой точки:
  • Повернуть коленвал по часовой стрелке за болт, до совмещения метки на зубчатом шкиве с усиком на задней крышке ГРМ.
  • Снять заглушку окна в верхней части кар­тера сцепления и убедиться, что риска на расположена напротив про­рези шкалы.
  • Зафиксировать коленвал от проворачивания, вставив через окно отверт­ку между зубьями маховика.

    Далее:
  • Вывернуть болт крепления шкива привода генератора, удерживая отвертку. Снимаем шкив привода генератора.
  • Ослабить гайку натяжного ролика. Снять ремень ГРМ, повернув ролик так, чтобы ремень стал максимально ослаблен.
  • Снять натяжной ролик, вывернув гайку его крепления.

    Заметили, что жрет или сползает ремень ГРМ? Причина может быть в бракованном ремне, роликах, перетянута шпилька.
  • КАК УСТАНОВИТЬ И НАТЯНУТЬ РЕМЕНЬ ГРМ
    Надеть ремень РГМ на шкив коленвала.
  • Натягивая обе ветви ремня, надеваем заднюю ветвь на шкив помпы и заводим ее за натяжной ролик.
  • Переднюю ветвь надеваем на шкив распредвала.
  • Натянуть ремень ГРМ, поворачивая натяжной ролик против часо­вой стрелки, вставив отвертку (как на фото).
  • Завернуть болт крепления шкива привода генератора и проворачиваем за болт коленвал на 2 оборота по часовой стрелке.
  • Проверяем совпадение меток коленвала и распредвала. Если метки не совпадают, повторяем операцию по установке ремня.

Выставить метки грм гранта 8 клапанная – Защита имущества

Хочу поделиться наблюдением по меткам ГРМ, которыми некоторые ( судя по интернету ) пренебрегают. А именно — ниже …

Вспоминалось мне тут поведение машины когда она была новая. Летала, динамика была на высоте. Время шло, пробег неумолимо продвигался, масло жралось и тд и тд. В итоге я просто стал замечать, что что то не то, нет той прыти, резвости . Пинял на все, но точно не на то, что скорее всего где то накосячили: либо я когда разбирал ГРМ, либо в сервисе, когда меняли МСК ( сальники клапанов ) .
Короче, про вот это ( доп метка ВМТ ) я узнал ровно год назад, мне хотелось проконтролировать работников сервиса, хотя они утверждали, что не разбирали ГРМ. Это сейчас до меня дошло, они и вправду не разбирали, а метку скорее всего выставляли по отвертке в цилиндре, искали ВМТ клоуны так. На сколько сейчас я помню, вроде доп метка эта совпала, но не уверен на 100% . короче смирился и катался…
Да думаю и хрен с ним!
Заводится? — Заводится! Не троит? — Не троит! Едет? — Едет!
Потом еще несколько раз за год ремонтировал, снимая грм …
Короче откатал так минимум 30000-40000км, а то и все 60. И тут недавно проверял ролик и дай думаю попробую выставить по центру. Ха, выставил! Со второго раза правда, ну кривые руки, что поделать

Что мы имеем теперь:

1 — Заводится идеально ( заводилось прекрасно но стало еще лучше, с полоборота )
2 — Пропала тряска на хх ( оказывается она была)
3 — Упал расход на ХХ до 06-07лч, был 07-08лч ( больше 08 ), 07лч уже при 40-45гр двигателя.
4 — Открылись низа и особенно верха. Ранее не мог раскочегарить больше 160-165 , щас думаю поедет больше, не пробовал, просто чувствуется!
5 — Машина на скорости ревела при 120кмч, как должна так реветь при 160 ))
6 — Двигатель стал эластичнее работать

И это еще на газу катаюсь.

Полазав по интернету, многие этим страдают, передвинут на 1 зуб ремешок. В этом нет ничего криминального, не сразу заметишь подвох, все зависит от авто. Но когда ты катаешься и тебе кажется от старости авто это все происходит и из-за болячек, то не думаешь а ездишь, миришься! Так и должно быть как будто … А когда все на свои места встает — тихонько охереваешь. Как так можно было, КАК ? КАК? Обонгуть земной шар ( по километражу пройденному со сбитыми метками )
Короче, проверяйте метки, наверняка у большинства конечно же все в порядке. Но водители разные … Кто то сам делает, кому то в сервисе, кто то просто не заметил сбитой метки.
В инете опять же полно инфы как и куда уходят фазы или как их там, в зависимости куда побежала метка.У меня больше было по часовой ушла метка. 1 зуб распреда = 8 градусам на коленвале. Это очень много оказывается. По- моему поршень еще не доходил у меня до ВМТ, а впуск уже открыт был при закрытом выпуске, поправьте если не так. наверняка спецы найдутся, я с удовольствием почитаю!
Успехов! Спасибо за внимание. Извините за подробности… накипело )

Все последние модели автомобилей с передним приводом, которые производит автозавод, находящийся в г. Тольятти, имеют зубчатый ремень в механизме газораспределения. Лада Гранта в полной мере относится к этим моделям.

Машину комплектуют несколькими модификациями двигателей, которые могут иметь 8 или 16 клапанов в головке блока цилиндров. Многие владельцы обслуживают и ремонтируют эту модель самостоятельно, поэтому им будет полезно узнать о том, как меняют ремень ГРМ на Ладе Гранта с 8 клапанами.

О двигателях

Моторы Лада Гранта имеющие 8 клапанов в головке блока цилиндров имеют индекс 11183 и 11186. Первый из них начали выпускать в 2004 году, второй позже, а именно в 2011 году. Мощность «83» агрегата составляет 82 лошадки, при 87 л.с для «86» модификации. Мотор 11186 представляет собой усовершенствованный движок «83» модели. В нём используют облегчённую шатунно-поршневую группу. Удалось достичь снижение массы поршневой группы почти на 30%. Головка блока цилиндров подвергается специфической термообработке, что повышает её прочность и износостойкость.

А также получила некоторые изменения система охлаждения силового агрегата. Юбки облегчённых поршней покрывают графитовой смазкой, это позволяет избежать появления задиров на цилиндрах непрогретого мотора. Степень сжатия «86» мотора стала 10,5 против 9,6 у «83» модификации. Прокладка ГБЦ нового мотора теперь тоньше, она равна 0,43 мм против 1,2 на старой модели. Диаметр впускных клапанов увеличили, что улучшило наполняемость цилиндров топливовоздушной смесью.

Загибает ли клапана

Такая проблема, к сожалению, присутствует для Лада Гранта. Она появилась с момента начала производства первых автомобилей с приводом на передние колёса ВАЗ 2108. В дальнейшем был увеличен рабочий объём силового агрегата этой модели, он стал равным 1,5 литра. Индекс двигателя стал 21083, в котором поршня имеют выемку в головке. Это позволило исключить встречу поршней с клапанами при обрыве зубчатого ремня в приводе ГРМ или неправильной его установке. За основу движка для Гранты был взят именно этот силовой агрегат, поэтому загибов клапанов не происходило.

Модернизация этого мотора до модели 11186 предусматривает установку облегчённых деталей шатунно-поршневой группы. Поршня стали короче по высоте, что не позволяет сделать углубления в головке для исключения встречи с клапаном. Поэтому обрыв зубчатого ремня всегда сопровождается повреждением клапанов на 8 клапанной Гранте, иногда шатунов, поршней. Эта проблема сопровождает все последующие модификации моторов для Лада Гранта.

Процедура замены

Многие владельцы этого автомобиля предпочитают проводить эту операцию в специализированных мастерских, но некоторые выполняют её своими руками. Ничего сверхсложного в этой процедуре нет, нет надобности приобретать специальное оборудование или приспособления. Заменить зубчатый ремень можно в гараже самостоятельно. Потребуется приготовить набор гаечных ключей, монтажная лопатка, домкрат, подставку под кузов, противооткатные колодки, перчатки, ветошь. В качестве ключа для регулировки натяжного ролика подходят круглогубцы с загнутыми концами.

Замена ремня ГРМ на Лада Гранте выполняется в примерно такой последовательности:

  1. Автомобиль устанавливают над смотровой ямой или на ровной поверхности, затягивают трос ручного тормоза, под задние колёса устанавливают противооткатные колодки.
  2. Открывают капот моторного отсека, отсоединяют клеммы от аккумуляторной батареи.
  3. Работе будет мешать ремень привода генераторной установки, поэтому его снимают.
  4. Теперь «5» номером шестигранника выворачивают четыре винта, которые крепят передний защитный кожух привода газораспределительного механизма.
  5. Чтобы случайно не повредить датчик положения коленчатого вала, его следует снять с головки блока цилиндров и отложить в сторону. Нельзя допускать попадания металлических опилок на датчик, они могут в дальнейшем исказить его показания.
  6. Далее необходимо установит поршень первого цилиндра в положение верхней мёртвой точки.
  7. Снятию зубчатого ремня мешает шкив привода генератора на коленчатом валу, который следует демонтировать. Для этого срывают колёсные болты правого переднего колеса, приподнимают кузов автомобильным домкратом.
  8. Под кузов устанавливают подставку, колесо снимают, защитный щиток на брызговике.
  9. Чтобы снять шкив коленчатого вала нужен помощник. Попросите его включить пятую передачу и сильно надавить педаль тормоза. Некоторые специалисты вставляют мощную отвёртку в люк на кожухе коробки передач между зубьев маховика.
  10. Приложив некоторое усилие к головке «17» отворачивают болт, снимают шкив с коленвала.
  11. Снова потребуется пятый номер шестигранника, которым нужно вывернуть три винта нижнего защитного кожуха механизма ГРМ, после этого можно снять защиту.
  12. Теперь необходимо отпустить болт фиксации натяжного ролика, лучше всего для этого подходит накидной ключ на «15». После этого ролик провернётся, ослабит натяжение приводного ремня, который легко снимается с зубчатых шестерён и достаётся из моторного отсека.

Важно! После этого нельзя проворачивать коленчатый вал двигателя, чтобы не произошла встреча поршней с клапанами.

Обычно замена ремня производится совместно с натяжным роликом и насосом охлаждающей жидкости, поэтому их необходимо демонтировать с блока цилиндров. Под роликом имеется регулировочная шайба, которую устанавливают обратно при сборке. При снятии помпы сливают некоторое количество антифриза в заранее подготовленную ёмкость. Установку нового ремня газораспределительного механизма проводят в обратном порядке. Обращаем внимание, что нужно проверить положение всех установочных меток на коленвале и распредвале, блоке цилиндров и, защитном кожухе ГРМ.

Установка меток

Это важная процедура при замене ремня газораспределительного механизма, поэтому отнестись к ней необходимо со всей серьёзностью. На этом моторе имеется четыре установочные метки в приводе ГРМ. Две на шестернях коленвала и распредвала, одна на блоке цилиндров в районе коленвала, последняя находится на металлическом защитном кожухе. Ещё две метки находятся на маховике и кожухе коробки передач. Их хорошо будет видно при снятой резиновой заглушке. Именно метки маховика и кожуха коробки укажут на положение поршня первого цилиндра в верхней мёртвой точке.

Проворачивают коленчатый вал ключом на «19» по часовой стрелке до того, как совпадут все метки механизма. Метка шкива распредвала в виде конусного углубления или прилива будет находиться в горизонтальном положении и совпадать с выступом на защитном кожухе. Метка на шкиве коленвала будет смотреть строго вертикально и совпадать с меткой на блоке цилиндров.

Натяжение

Установленный новый зубчатый ремень необходимо натянуть до требуемых параметров. Перед этим обязательно ещё раз проверяют положение установочных меток, если с ними всё в порядке, можно произвести натяжение привода. Для этого необходимо провернуть против часовой стрелки натяжной ролик до совпадения на нём меток. Одна метка в виде выреза имеется на наружной обойме, вторая на внутренней в виде выступа. Провернуть натяжной ролик можно специальным ключом, круглогубцами.

Некоторые мастера вставляют в отверстия на подвижной части ролика подходящие по диаметру свёрла. Между ними отвёртку в качестве рычага и проворачивают обойму до совпадения меток. После этого можно затянуть винт крепления натяжного ролика. После того как все работы произведены, необходимо вручную провернуть на несколько оборотов коленвал, убеждаясь в том, что метки не сдвинулись. После этого можно установить защитную крышку.

Через сколько произвести замену

Заводская инструкция по эксплуатации автомобиля рекомендует проводить замену зубчатого ремня при пробеге 75 тыс. км. Эта норма выполняется владельцами далеко не всегда, этому есть веские причины. Сколько ходит привод до замены зависит от многих факторов. Это качество используемых деталей, условий эксплуатации транспортного средства, технического состояния двигателя. При проведении каждого ТО следует проверять натяжения и состояние привода ГРМ. При появлении трещин, отслоений, других повреждений ремень меняют.

При большом пробеге машины происходит естественный износ шкивов коленчатого и распределительного вала, это значительно сокращает срок службы всего привода ГРМ. А также привод боится попадания моторного масла в зону работы ремня. Оно размягчает его структуру, зубья легко срезаются. Если автомобиль длительное время стоял без движения, также лучше заменить привод из-за его старения. Большинство владельцев, специалисты рекомендуют менять ремень при пробеге 50 тыс. км.

Какой комплект приобрести

Кроме зубчатого ремня приобретают натяжной ролик, насос охлаждающей жидкости. Основным поставщиком резинотехнических изделий является завод РТИ в г. Балаково. Хорошо зарекомендовали себя изделия от компаний GATES, BOSCH, DAYCO, CONTITECH. Если будет заменена помпа в системе охлаждения двигателя, понадобиться антифриз на доливку.

Обрыв ремня ГРМ и его последующая замена – довольно распространенная проблема среди владельцев автомобиля Гранта, как с 8-ми клапанным двигателем, так и с мотором на который установлено 16 клапанов.

Очень часто среди автолюбителей можно услышать разговор о том, что из-за порванного ремня заклинило двигатель или «погнуло клапана». Отчего это происходит и как предотвратить подобное явление, а также о том, как поменять деталь самостоятельно, пойдет речь в нашей статье.

Ремень ГРМ. Для чего он нужен

Для передачи крутящего момента от коленвала к системе газораспределения в большинстве современных автомобилей используется приводной ремень. Автослесари и водители называют эту деталь — ремень ГРМ. Это изделие из прочной резины, армированное специальным кордом из стекловолокна. Для лучшего сцепления он имеет зубья, которые совпадают по размеру с выемками на шкивах коленвала и распредвала.

Ремень выполняет исключительно важную функцию в работе двигателя, обеспечивая бесперебойный цикл впускного и выпускного механизма, и выводя выхлопные газы наружу.
Кроме валов двигателя, ремень ГРМ на Гранте 8 клапанной приводит в движение и насос охлаждающей жидкости, который именуется «помпа». Без надежного привода работа силового агрегата невозможна в принципе, поэтому каждому водителю необходимо внимательно следить за целостностью детали и проводить замену этого элемента в установленные сроки.

Период замены ремня ГРМ на Гранте

Производитель автомобилей Лада, концерн АвтоВАЗ, предусматривает сроки замены ремня Гранты — 75 тыс. км пробега. Установленный термин распространяется как на все автомобили Гранта, независимо от количества клапанов.

Помимо плановой замены, предусмотрительный водитель всегда контролирует состояние привода, так как он может оборваться раньше срока, вследствие своего плохого качества или неправильной установки. Поэтому решение «через сколько менять ремень ГРМ на Гранте?» каждый водитель принимает самостоятельно.

Почему ремень может внезапно оборваться

В некоторых случаях даже новая деталь может вдруг порваться, причинив хозяину транспортного средства массу неудобств. Чаще всего зубья стираются из-за того, что установка ремня ГРМ Гранта была произведена неправильно. В таком случае, он ходит по шкивам и роликам криво и его зубья «съедают» металлические элементы шкивов.

Другими причинами преждевременного износа могут быть:

  • Плохое качество детали. В данном случае экономия может сыграть злую шутку с водителем, поэтому совершать покупку нужно в проверенных магазинах
  • Неисправность помпы. Это одна из наиболее частых причин поломки. Валики помпы со временем разбиваются, образуя зазор, и смещают ось. От этого его зубцы быстро стираются и приводят к обрыву.
  • Неисправность натяжного ролика. С роликом может произойти то же самое, что и с попой. Неисправность подшипника создает люфт и смещает ось натяжения.
  • Утечка масла или антифриза. Попадая на ремень, технические жидкости разрушают резину, из которой он сделан, и очень сильно влияют на прочность детали
  • Износ зубьев шкивов. Если шестерни распределительного или коленчатого валов сильно повреждены, это немедленно отразиться на целостности. В этом случае зубцы будут иметь расслоения на своей поверхности.

Кроме всего вышеперечисленного, к тому, что на Ладе Гранта 8 клапанной ремень ГРМ внезапно порвался, может привести банальная причина его несвоевременной замены.

Если периодичность замены ремня ГРМ Лада Гранта нарушена, то водителю следует рассчитывать не только на покупку нового, но и возможно, на полный ремонт двигателя. Причину разрыва можно диагностировать по следующей схеме:

Последствия обрыва зубчатого ремня. Так ли все страшно

На автомобилях Гранта производитель устанавливает несколько видов силовых агрегатов.

Первые два являются восьми клапанными, а остальные – 16-ти. Печальные последствия в виде испорченных клапанов из-за обрыва ремня ГРМ на Гранте грозят всем этим моторам, за исключением ВАЗ-11183-50.


Это происходит таким образом. Когда на автомобиле Гранта ремень ГРМ рвет на высоких оборотах, это приводит к тому, что связь между валами двигателя теряется. Распределительный вал резко останавливается, а коленвал продолжает свое движение, так как мотор работает.
В результате поршень резко ударяет по неподвижным клапанам, которые могут погнуться и даже поломаться. Такие повреждения грозят дорогим ремонтом всей системы газораспределения, а если при ударе пострадал и поршень, то заменой поршневой группы, что еще дороже.

ВИДЕО — Оборвало ремень ГРМ и загнуло клапана Лада Гранта

Как определить, что скоро может произойти обрыв

Срочная замена ремня ГРМ на автомобиль Гранта 8 и 16 кл. может понадобиться, если наблюдаются следующие явления:

  1. Падение мощности автомобиля. Плохо натянутый или изношенный привод может затруднять пуск двигателя и сокращать показатели мощности
  2. Непонятные шумы ремня ГРМ на Гранте, исходящие из моторного отсека. Клацанье, тиканье или странный шорох, часто свидетельствует о том, что ремень ГРМ Granta поврежден и трется о кожух или другие детали под капотом
  3. Видимые повреждения. На детали могут быть потертости, трещины и «лохматые» участки, заметные невооруженным глазом.

Если при внимательном осмотре обнаружилась, что срезало зубья на ремне ГРМ Гранта или хотя бы одна из других перечисленных проблем, необходимо срочно заменить деталь новой, что вполне возможно сделать самостоятельно.

Замена ремня на 8-ми клапанном двигателе Lada Granta.

Подробное описание

Убедившись в том, что деталь в плохом состоянии, необходимо подготовиться к процедуре замены ремня ГРМ на Лада Гранта 8 клапанов. Прежде всего, нужно обеспечить удобное место для работы, хорошо освещенное, достаточно просторное и безопасное.

Из инструментов вам понадобится:

  • Гаечные ключи в наборе
  • Головки с удлинителем
  • Монтировка
  • Специальное приспособление для регулировки ролика

Ролик натяжителя часто меняют одновременно, поэтому необходимо его приобрести заранее. Во всех магазинах можно купить ролик ремня ГРМ на Гранту в комплекте.

Перед началом работ необходимо открутить провод массы от аккумуляторной батареи.

Рассмотрим процесс замены ремня ГРМ на автомобиле Лада Гранта на примере с8-ми клапанного двигателя. Основные этапы работ:

Подготовка к ремонту. Автомобиль поднимается на домкрат и снимается переднее колесо с правой тороны, а также защита, которая перекрывает доступ к двигателю.

Демонтаж защитной крышки. На автомобилях Гранта пластиковая крышка состоит из двух частей. Снять ее просто. Для начала необходимо открутить 4 болта верхней части, а затем – нижней.

Использовать для этого нужно шестигранный ключ на 5. Кроме крышки, нужно демонтировать также датчик положения коленвала, просто отсоединив его от разъема и вынув из гнезда.

Совмещение меток. Перед тем как производить замену ремня ГРМ на Гранта 16 и 8 клапанов, необходимо правильно установить фазы газораспределения двигателя. Для этого нужно провернуть коленвал по часовой стрелке. Делается это с помощью головки на 17. Крутить нужно, пока метка на зубчатом шкиве распределительного вала не совпадет с отметкой на внутренней поверхности крышки ГРМ.

Кроме этого, отметки должны совместиться и на маховике двигателя. Проконтролировать это можно через специальный лючок в верхней части картера сцепления. Вынув резиновую заглушку, необходимо убедиться, что специальный выступ на маховике совпадал с меткой распредвала.

Только после этого можно продолжать замену ремня ГРМ на Ладе Гранта.

Снятие шкива генератора. Чтоб выставленные по меткам валы не проворачивались, маховик можно застопорить через смотровой лючок. Сделать это удобней всего с помощью толстой отвертки или монтировки. Закрепив прочно маховик аккуратно откручиваем гайку, держащую шкив генератора и демонтируем его вместе с шайбой.

Далее послабляем гайку шкива генератора

Регулировка натяжного ролика. Гаечным ключом на 15 необходимо постепенно ослабить затяжку болта крепления ролика. Когда крепление будет ослаблено достаточно для провисания, можно начать демонтаж, убедившись еще раз, что все метки совпадают.

Снятие. Деталь аккуратно снимают со всех шкивов и вынимают из моторного отсека. Если произошел полный обрыв ремня ГРМ на автомобиле Гранта, сделать это еще проще.

Полезный совет: в то время, когда вы будете менять ремень ГРМ на Гранте, защитный кожух снят, и можно проверить состояние водяного насоса и ролика натяжителя. Ролик снимают и прокручивают в руках. Если нет посторонних шумов, и подшипник не заклинивает, его устанавливают обратно. Водяную помпу проверяют, покрутив ее за шкив. Если ничего не заедает – она в порядке.

Установка новой запчасти. Перед эксплуатацией ремень ГРМ на Гранту 8 клапанов проверяется на наличие заводских дефектов – отслоений, трещин, излишней грубости материала. Нелишним будет посмотреть срок годности, так как резина теряет свои свойства, даже не будучи в употреблении, а пролежав на полке несколько лет. Число зубьев у ремня Lada Granta с двигателем 8 клапанов равняется 113, а его ширина составляет 17 мм. Установка детали производится в обратном порядке. Сначала его натягивают на коленвал, потом на генератор и помпу, обводя ролик, а в самом конце – на распредвал.

Натяжение. Чтобы обеспечить хорошую натяжку, необходимо прокрутить ролик против часовой стрелки. Делается это с помощью специального ключа, который представляет собой 2 металлических стержня. Они вставляются в соответствующие отверстия на ролике, и он прокручивается, пока вырез на обойме ролика не совпадет с прямоугольной отметкой на внутренней втулке. Только после этого болт ролика можно закручивать.

Для того чтоб понять последовательность работ, представляем вашему вниманию
поясняющее видео о том, где искать метки:

ВИДЕО — Метки зажигания на инжекторе. Замена ремня ГРМ на 8кл моторе. Зазор между ДПКВ и шкивом зажигания

Замена ремня ГРМ на 16-ти клапанном моторе. Особенности процесса

Процесс замены ремня ГРМ на Гранте 16 клапанов мало чем отличается от аналогичного процесса на 8-ми клапанном. Но есть и некоторые отличия, которые состоят в том, что 2 распредвала имеют другие метки и выставляются они несколько иначе.

Помимо этого, замена ремня ГРМ Гранты 16 клапанов автомат усложнена тем, что для проведения этих работ необходимо снять стартер, который закрывает доступ к маховику.
Размер ремня ГРМ Лада Гранта с 16-ти клапанным мотором – 137 зубьев при ширине 22 мм.
Демонтаж стартера на Ладе Гранта
Произвести снятие стартера несложно. Для этого достаточно произвести следующие действия:

  • Отсоединить от стартера пластиковые разъемы
  • Открутить гайку, которая держит силовую клемму. Для этого используется ключ на 13
  • Тем же ключом выкрутить 3 болта, которые крепят стартер к кронштейну
  • Придерживая корпус стартера, аккуратно отсоединить его.


После снятия этого элемента можно приступать к замене ремня ГРМ.
Как выставить метки на Гранте с 16-ти клапанным мотором
Так как 16-ти клапанная машина имеет 2 распредвала, метки на каждом из них должны совпадать с выемками на верхней части крышки ГРМ, а также с маховиком двигателя. Прокрутив коленчатый вал вправо до совпадения этих меток, распредвалы нужно зафиксировать. Для этой цели прекрасно подойдет небольшой брус мягкой древесины или резиновый упругий кусок.


После того как метки совпали, маховик фиксируется таким же образом, как и на 8-ми клапанных моделях.

В моторе с двумя распределительными валами кроме натяжителя ремня ГРМ Гранта, имеется также опорный ролик. Он выполняет функцию дополнительной стабилизации ремня, регулировки его правильного положения по отношению к другим деталям и лучшего функционирования всей ременной передачи. Как и натяжной ролик, его нужно проверить на наличие дефектов и при необходимости заменить новым.


Натяжка ремня

Как натянуть ремень ГРМ на Гранте с 16 клапанами? Процесс особо не отличается от замены ремня на Лада Гранта 8-ми клапанной. Начинать нужно с нижнего шкива (коленвала). Потом обвести шкив генератора и помпы, правильно расположив деталь по роликам, а после – надеть ее на шкивы распределительных валов.

Как выбрать качественную запчасть

Ремень ГРМ Lada Granta играет в работе двигателя первостепенную роль, поэтому выбирать его необходимо внимательно. В процессе передвижения эта деталь выдерживает огромные нагрузки, и она должна быть самого высокого качества. На сегодняшний день существует несколько проверенных производителей, продукция который заслуживает высоких оценок. Самые известные и хорошие ремни ГРМ на Гранту торговых марок:
• Contitech
• Gates
• Dayco
• Bosch
Среди отечественных производителей можно выделить компанию БалаковоРезинотехника (БРТ), которая обеспечивает ресурс ремня ГРМ Гранты и доступную цену.

Для удобства подбора на 16-ти клапанную Гранту, можно воспользоваться следующей таблицей:

Бренд Каталожный номер
БРТ 2112-61006040
Lynx 137FL22
Conti CT1137
Bosch 1987949662
Gates 5631XS
Contitech CT1137
Dayco KTB944

Приобретая продукцию известной фирмы, каждый водитель думает о том, какой лучше ремень ГРМ на Гранта. Но кроме этого, владелец автомобиля должен быть внимательным, чтоб не попасть на подделку. Проверять необходимо наличие голограмм и других опознавательных знаков, которыми пользуется та или иная компания, а также совпадения оригинального номера детали и надписи на коробке.

Покупать запасную часть следует только в проверенных торговых точках, которые несут полную ответственность за качество продаваемой продукции.

Отзывы

А принять решение о том, какой ремень ГРМ на Гранту подойдет именно вам можно на основании отзывов владельцев этого автомобиля.

Олег: после того, как нарвался на бошевскую подделку, предпочитаю продукцию отечественного производителя. Уже второй раз покупаю ремень БРТ. Ходит положенные 75 тысяч без проблем. Недавно поменял и ролик натяжной. Поставил вологодский, посмотрим, как себя покажет

Виталий: Предпочитаю не экономить на запчастях, поэтому устанавливаю только немецкого производителя Gates. С ним можно чувствовать себя спокойно даже в длительной поездке.

Слава: самый надежный и проверенный вариант – производитель Contitech. Он хоть и дороже Боша, но по качеству в разы лучше. Мы с другом (у него Калина) покупали одновременно. Он взял что подешевле, российского производства. Меня же продавцы уболтали на Contitech. Я очень доволен, потому что товарищ уже давно свой выбросил, а я все еще езжу на нем. Он хоть и с виду как новый, но думаю поменять, уже больше 130 тысяч прошел. Буду брать такой же.

Замена ремня ГРМ на Лада Гранта. Процесс замены ремня

Двигатель современного автомобиля является сложной системой, включающей массу узлов, механизмов и агрегатов, направленных на одну цель – заставить автомобиль двигаться с максимальным комфортом для водителя. И отечественные автомобили качеством и прочими характеристиками не уступают заграничным вариантам. Сегодня уделим внимание второму по важности механизму двигателя – газораспределительному, рассмотрим строение и принцип осуществления привода ГРМ на автомобиле Лада Гранта.

Предназначение приводного ремня 

В нынешних автомобилях для осуществления вращения распределительного вала используются такие варианты:

Ременной привод распределительного механизма считается наиболее оптимальным, так как от его работы практически не исходит шум. В этом плане ременной привод выигрывает, но одновременно с этим проигрывает в надежности – за состоянием приходиться следить.

Назначение приводного механизма сводиться к передаче вращательного движения от коленчатого вала двигателя к распределительному, он обеспечивает жесткую связь между ними. За счет этого достигается слаженность работы мотора, своевременность открытия и закрытия клапанов, правильность протекания внутренних процессов.

Причины неисправностей

Наиболее частая поломка распределительного механизма заключается в конструкции ремня. Поскольку он выполнен из резины ему свойственно разрываться на исходе ресурса, это и является проблемой. Поэтому уделим этому моменту толику времени, чтобы узнать причины разрыва ремня.

А они легко обобщаются в такой список:

    • Выход ресурса;
    • Масляная течь из мотора;
    • Выход из строя вспомогательных элементов.

Старость приводного ремня является наиболее частой ошибкой людей, имеющих Ладу Гранту и подобный автомобиль. Как и каждый элемент в машине он имеет срок службы, который рано или поздно выходит, ремень лопается. Это приводит к серьезным последствиям для двигателя. Поэтому ремень желательно заменять до того, как подойдет контрольный срок.

На втором месте по частоте случаев стоит масляная течь, которая способна серьезно укоротить срок службы приводного ремня. Для него опасна и течь из-под клапанной крышки, головки блока цилиндров, сальников валов – оттуда они сразу попадут на ремень. Учитывая, что ремень выполняется из резины, то он крайне восприимчив к бензинам, маслам и другим горюче-смазочным материалам. При попадании масла на поверхность ремня между этими двумя элементами начинается химическая реакция, вследствие которой теряются эластичные и прочностные свойства ремня.

В последнюю очередь на разрыв ремня оказывают влияние второстепенные элементы привода вала: ролики, натяжители и прочие устройства, участвующие в обеспечении привода вала. Даже сам вал нередко становится причиной разрыва: если он или какой-либо другой элемент заклинит, то приводной ремень лопнет, тут уж ничего не поделаешь. Остаётся лишь стараться своевременно следить за состоянием вспомогательных элементов, чтобы в случае чего не было непредвиденных поломок.

Определяем, когда пора заменять ремень

В технической документации, что поставляется вместе с Ладой Грантой, указано, что проверять состояние ремня следует каждые 15 тысяч пройденных километров. Выполняется это по такому алгоритму:

    • Передняя часть машины вывешивается на домкратах;
    • Включаете в коробке высшую передачу;
    • Под капотом разбирается защитный кожух привода;
    • На этом этапе желательно найти помощника, который станет вращать колесо, пока вы будете под капотом изучать состояние ремня.

Если при визуальном осмотре выявляются дефекты, несовместимые с нормальной работой: выломанные зубья, трещины резины и прочее, то следует не заводя двигатель заменить ремень, чтобы не рисковать.

Подготовка и подбор инструментов

Учтите, что по плану проведения мероприятий с ремнем принято заменять и ролики вместе с натяжителями. Эти изношенные детали нередко приводят к тому, что новый ремень быстро придет в негодность и порвется. Если же натяжители не справятся с поставленной задачей, то это станет причиной сбитых фаз газораспределения, что приведет к неровной работе мотора или не работе вообще. Заменить старый ремень на новый получиться у каждого владельца машины, если у него найдутся следующие инструменты:

    • Набор рожковых ключей и головок под каждый размер;
    • Небольшая монтировка;

8 и 16-ти клапанные двигатели

Автомобиль Лада Гранта с завода комплектуется двумя различными видами двигателей: восьми и шестнадцати клапанными. Различие здесь помимо количества клапанов еще и в том, что первый вариант комплектуется одним распределительным валом, а второй двумя. Соответственно, для привода во втором варианте используется две шестерни и два специальный обводных ролика, устанавливаемых ниже этих шестерен. Разницы в проведении работ практически нет, не забудьте только купить ремень подходящий под ваш мотор – у них разная длина.

Приступаем к замене ремня

Теперь пришло врем разобраться в том, как проводиться замена приводного устройства. Начинаем с того, что отключаем аккумулятор от машины. Чтобы исключить возможность ошибки при выставлении ремня совместите риски на валах двигателя, это делается вращением коленчатого вала. Когда метки выставлены снимите резиновую заглушку с корпуса коробки передач, в ней откроется маховик, риска на нем также должна совпасть с меткой на кожухе.

На следующем этапе снимаем ремень привода генератора, для этого придется ослабить специальный болт, который крепит генератор, немного подвинуть в сторону и снять ремень. После этого ключом ослабьте крепление шкива. Нередко случается и так, что шкив накидным ключом открутить не получается, приходиться подходить к делу творчески:

    • Через смотровое окошко заблокируйте маховик, чтобы он не вращался;
    • С помощником дела пойдут быстрее: он включит передачу и зажмет тормоз – это заблокирует вал двигателя;
    • Если подкапотное пространство позволяет, то надев длинный ключ на шкив он упрется в кузов и застопорит вал.

Открутив болт аккуратно снимите шкив вала и сразу ослабляйте натяжной ролик, чтобы получилось снять ремень. Ролик, натяжитель и крышка держатся на болтах, которые легко откручиваются.

Собираем механизм обратно

Этот процесс производится в противоположном прошлому направлении. В первую очередь еще раз гляньте, что метки находятся в нужном положении. После этого устанавливаете новый натяжитель, а поверх шестерен накидывается свежий ремень ГРМ. Начинайте снизу, двигаясь вверх поддерживайте ремень натянутым и наденьте на шестерни распределительных валов.

Натяжение регулируется роликом, сбоку которого есть два отверстия. В них удобно вставлять круглогубцы или специальную регулировочную вилку. Выставив натяжение затяните болт ролика со средним усилием. Проверьте правильность монтажа пару раз провернув ключом коленчатый вал. Выполните пару полных оборотов вала и посмотрите, чтобы метки четко совпадали.

Теперь предстоит поставить на место генератор, при этом не забудьте, что натяжительного механизма здесь нет. Поэтому сперва придвиньте генератор к двигателю и наденьте на него ремень. На шкив вала он надевается частично, после чего вал проворачивается и ремень становиться на место. По аналогии с тем, как это делалось с цепью на старых велосипедах, ничего сложного. Далее собирайте в обратном порядке и запускайте мотор для проверки. На 16-ти клапанном двигателе алгоритм такой же, за исключением того, что роликов ставиться два, плюс еще и обводные ролики ставить нужно.

При проведении работ обратите внимание на чистоту в узлах распределительного механизма, осмотреть места, в которых может наблюдаться течь масла. Если таковая есть – устраните, чтобы в будущем проблем не было. При монтаже протрите трущиеся поверхности от пыли и грязи, удалите остатки старого ремня, нередко там остаются куски резины, черный порошок от работы резины. Не поленитесь и протрите блок двигателя, чтобы в случае чего быстро заметить начинающиеся неполадки.

Подводим итоги

Как видим, в замене приводного ремня газораспределительного механизма ничего сложного нет и, обладая минимальным набором домашнего инструмента, справиться с этим делом не проблема. Главное при покупке не забыть сказать, какой у вас двигатель, и потом следовать каждому пункту инструкции. Тогда вы выполните поставленную задачу быстро и наберетесь автомобильного опыта.

Остинских музыкантов получили $ 250 000 на Black Fret Ball 2019

Доктор Джо взрывным образом закрыл Black Fret Ball 2019 (Фото: Билл Такер)

Музыка - это кровь Остина. Любой, кто говорит вам иное, не провел субботний вечер на Ред-Ривер и не обнаружил случайного исполнителя во время SXSW. В любой вечер в районе Большого Остина на выбор предлагается 100 представлений. Музыка - это часть того, кто мы есть.

Но вена начинает свертываться. Рост стоимости жизни, более высокая арендная плата за залы и десятки вариантов развлечений вынуждают артистов мирового уровня стагнировать.

Введите Black Fret , некоммерческую организацию, занимающуюся оказанием финансовой и практической поддержки музыкантам Остина. 7 декабря 2019 года во время ежегодного гала-концерта Black Fret Ball группа наградила 250000 долларов 19 местным артистам. Это был вечер сердца, общности и щедрости.

Что такое черный лад?

Соучредитель Black Fret Мэтт Отт с Ley Line на красной ковровой дорожке Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

Основанный друзьями и коллегами-меломанами Колином Кендриком и Мэттом Оттом, Black Fret является участником 501 (c) 3, посвященная поддержанию процветания музыки Остина за счет денежных грантов, справедливо оплачиваемых концертов и профессионального наставничества.

Члены платят ежегодный взнос и, в свою очередь, получают доступ к десяткам интимных шоу в комнатах для прослушивания с участием одних из лучших местных талантов Остина. Средства направляются в фонд, который распределяется среди художников на основе голосов участников. На сегодняшний день Black Fret предоставил более 1,5 миллиона долларов в виде грантов и прямых выплат местным организациям.

Но получатели не получают мешок с деньгами со знаком доллара. Средства распределяются между обладателями грантов в рамках этапов развития карьеры.Нужен туристический фургон? Black Fret сокращает проверку. Студийное время для новой записи? Black Fret оплачивает все из назначенных долларов, которые получил артист.

Организация также предлагает программу наставничества. Выдающиеся профессионалы индустрии обучают артистов всему, от записи до продвижения по службе и подготовки к гастролям. И все деньги возвращаются в музыкальную экосистему Остина, создавая устойчивую среду для процветания сцены.

Все в духе дарения

Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

Год музыкальных выступлений и голосования участников завершился на Black Fret Ball.Отчасти концерт, отчасти вечеринка и отчасти раздача подарков Опры Уинфри - театр Moody Theater превратился в эпицентр щедрости и поддержки Остина. Каждый артист, номинированный на участие в конкурсе, получил крупный (20 000 долларов США) или второстепенный грант (7 000 долларов США).

Обычно мелкие гранты составляют 5000 долларов. Но в этом году Black Pumas пожертвовали свой основной грант обратно Black Fret, что позволило разделить средства между второстепенными победителями. Это увеличило сумму незначительного гранта до 7000 долларов. Это было удивительное проявление щедрости и заботы для музыкального сообщества Остина.

И победителями стали…

Основные получатели гранта: 20 000 долларов

The Texas K.G.B. получил крупный грант на Black Fret Ball 2019 (Фото: Билл Такер)
  1. Beat Root Revival
  2. Sydney Wright
  3. Superfónicos
  4. Dave Scher
  5. Ley Line
  6. Cari Hutson & Good Company
  7. The Watters
  8. The Watters
  9. The Watters Техасский КГБ
  10. Western Youth

Незначительные получатели грантов: 7000 долларов

Think No Think получили грант в размере 7000 долларов во время Black Fret Ball 2019 (Фото: Билл Такер)
  1. Tje Austin
  2. Go Fever
  3. Altamesa
  4. Cilantro Boombox
  5. Erika Веннерстрем
  6. А. Sinclair
  7. Good Field
  8. Джонатан Террелл
  9. Think No Think
  10. Dr. Joe

The Show, the Party, the Celebration

Beat Root Revival на Black Fret Ball 2019 (Источник: Билл Такер)

Концерт грандиозные пропорции были разбросаны среди дающей и хорошей вибрации. Впервые 17 из 20 номинантов выступили в рамках более чем четырехчасового мероприятия. Вечер начался с потрясающего выступления с двумя песнями гитариста / мультиинструменталиста Beat Root Revival.Управляющий бодран Андреа Маги соответствовал яростной игре на гитаре Бена Джонса, отчего Moody Theater погрузился в безумие танцев на стульях.

Среди других ярких моментов - захватывающий спектакль Эрики Веннерстром и театральное освещение (но трагически короткое по причине времени), поставленное фаворитом Остинота Superfónicos. Cilantro Boombox умолял толпу отложить телефоны в пользу живой жизни, а позже присоединился к Ley Line в трогательной дань уважения Дэниелу Джонстону. Их исполнение «Настоящая любовь найдет путь» было волшебным моментом.

Сидни Райт выступает на Black Fret Ball 2019 (Фото: Билл Такер)

Местные панк-рокеры Think No Think превратили гигантскую сцену Moody в трэш-сессию CBGB, а Джонатан Террелл представил кантри / рок-чванство в уже зажигательный вечер. И я был бы упущен, если бы не упомянул мощную, как Адель, команду Кари Хатсон на сцене.

Вечер завершился потрясающим исполнением двух песен доктора Джо, за которым последовало групповое исполнение «Lean on Me». Руки за плечи, несколько голосов в один микрофон, пение взбудоражило Moody Theater и подняло все еще раскачивающуюся публику на ноги.

Заключительный момент Black Fret Ball 2019 (Фото: Билл Такер)

Это был мой третий Black Fret Ball, и каждый раз я вспоминаю об особой связи, которую поддерживает это сообщество. В мире, где музыканты постоянно соревнуются за лайки, прослушивания, посетителей и стримы, приятно знать, что такая богатая сцена, как Остин, может быть семьей. А с такими выдающимися организациями, как Black Fret, создающими устойчивую среду для процветания музыки, будущее выглядит безоблачным.

Остинот является одним из основателей Black Fret.Чтобы получить дополнительную информацию и стать участником, посетите blackfret.org.


@BillTuckerTSP хочет знать:

Кто ваш любимый исполнитель Black Fret?

Практическое руководство по одиночным молекулам FRET

Nat. Авторская рукопись; доступно в PMC 2013 10 сентября.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC3769523

NIHMSID: NIHMS495771

, 1, 2 , 3 и , 4

Рахул Рой

1 Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр биофизики и компьютерной биологии Университета Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

3 Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

1 Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

4 Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

1 Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

2 Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

3 Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

4 Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Автор, ответственный за переписку. Окончательная отредактированная версия этой статьи издателем доступна на сайте Nat Methods. См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования полиэтиленгликоля (PEG) поверхности 9000

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Аннотация

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие, эти методы до сих пор практиковались в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Частично это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) по Фёрстеру (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих общепринятых протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкрепляются всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » 1 . Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это 2, 3 . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели мы предлагаем краткое, но практическое руководство по измерениям одиночных молекул FRET 4 (smFRET) 5-7 , одному из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного зарождения в неводных условиях в 1996 г. 8 smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, фолдинге и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, фолдинге белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в этой области и ссылкам в них 6, 9-13 .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () 4, 14, 15 . Эта эффективность передачи энергии E задается как E = [1 + ( R / R 0 ) 6 ] -1 , где R - расстояние между красителями. и R 0 - это радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределений популяций расстояний между красителями 16-19 . Однако возможность контролировать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию 20, 21 , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации поверхностных иммобилизованных молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных 5, 22 . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией 7 с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R 0 = 50 Å. Донорный краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R 0 , E = 0,5, а на меньших расстояниях это> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R 0 .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки 93 , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Вставка 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () - мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R 0 . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные расчеты для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

Схема эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции ε > 50 000 M −1 см −1 ; квантовый выход QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством биоконъюгированных химикатов. Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET 23 , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET 24 за счет химического подавления их мерцания 25 , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры - это небольшие (<1 нм) органические красители 26 . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, алекса- и атто-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Sua Myong, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию к спонтанному изменению своей интенсивности между тремя различными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители для ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат эффективными однокомолекулярными красителями и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждается позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

563640 3
Краситель Возбуждение λ макс. (нм) Излучение λ макс. Фотостабильность (и) b (в Trolox / β ME)
Доноры
Cy3 550 1 91/50
ATTO550 554 577 1,9 72/27 c
Alexa555 555 567 0,8 5 0,8 5
Акцепторы
Cy5 655 667 1. 0 82/25
ATTO3647N ATTO3647N 62/31
Alexa647 650 667 1,2 58/20 c

Повышение фотостабильности

Молекулярный кислород является эффективным тройным гасителем состояния красителя также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание 27 . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии 28 , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала. Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет мигание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода 28 . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 28 , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения со сверхвысоким разрешением 29 .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей 30 .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода 31 представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатехуиновая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа 32 , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места для маркировки должны быть выбраны таким образом, чтобы расстояние между красителями изменялось с меньшего на большее, чем значение R 0 (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET 33 , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот 34, 35 . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с основной цепью ДНК, красители должны быть внутренне конъюгированы с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения основной цепи. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу 36 , генетически кодируемую в геликазе Rep E.coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации для красителей или биотина

3 или RNA 90sphoram
Химия / метод Реактивная группа Замечание
ДНК / РНК (ACE) синтез твердой подложки Прямое включение в основную цепь
Реакционноспособный с амином (-NH 2 ) сложный эфир сукцинимидила (NHS) Амино C6- dT / dC (для внутренней маркировки без разрушения основной цепи )
Тиол-реактивный (-SH) Малеимид Тиоловый модификатор на 3'- или 5'-конце
Белки
Амино-реактивный (-NH 2 сукцинированный) (NHS) сложный эфир N-конец или аминогруппа лизина a
Тиолореактивный (-SH) 9 0365 Малеимид Цистеиновая тиоловая группа b
Кетонореактивный (= CO) Гидразин Неприродная аминокислота с кетонной группой c

Выход флуоресценции даже с приемлемым выходом белка был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза 37, 38 ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы 26, 39 .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Обнаружение одиночных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии 40, 41 создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для пар FRET, обсуждаемых здесь, и гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн могут быть добавлены для проверки наличия акцептора.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (размером ∼0,05 мм 2 ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки - М, зеркальные; DM - дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения ПЗС. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается рядом на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).(b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид рамки на (а)). В PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под 40, 41 (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов по закачке жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не изгибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, производит ПВО на границе раздела стекло / вода 40, 41 (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сравнимыми с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

Микроскопия МДП приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых камер с электронно-умножением на заряженные пары (ЭМ-ПЗС) с передачей кадров 3, 42 . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые обладают высокой квантовой эффективностью (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низким эффективным шумом считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстродействием скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения таким образом, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров между каналами обнаружения возникают значительные перекрестные помехи (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность 43 . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

В то время как кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин 5, 22, 44 .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин - менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (PEG) 45 . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () 44 (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом 46 . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами 47, 48 . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с использованием хелатных групп Ni 2+ или Cu 2+ 49 , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидинового тега и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Yuji Ishitsuka, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифично связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).(b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновой составляющей, с помощью сэндвича с белком нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Поверхности, покрытые ПЭГ, могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni 2+ или Cu 2+ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6x His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для улавливания биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри поверхностно-привязанных фосфолипидных везикул 50-52 имитирует клеточный захват, уменьшает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков 53 , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем наложения двусторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм 2 ), препарат на предметном стекле считается приемлемым. После стрептавидина добавляют биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образцов изготавливается путем размещения предметного стекла микроскопа и покровного стекла двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с исх. 7 с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в канал (ы) акцептора и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных

Алгоритмы обработки данных

Чтобы преобразовать файлы фильмов во временные траектории одиночных молекул, мы сначала идентифицируем изолированные пики одиночных молекул из составного изображения донорных и акцепторных каналов (среднее значение первых десяти кадров), построенного с использованием сгенерированное отображение ( см. выше ). Совместно локализованные донорные и акцепторные пятна отбираются для окончательного анализа с целью удаления частично меченых молекул. Затем локальный фон вычитается из пиков, и интенсивности из 7 × 7 пикселей (в зависимости от общего увеличения), окружающие пик (соответствующий площади ∼ 1 мкм 2 ), интегрируются, чтобы восстановить интенсивности доноров и акцепторов для каждой отдельной молекулы для каждый кадр.В экспериментах, где ожидается только временное присутствие меченой донором молекулы 54 , первый шаг может быть выполнен для каждого набора из десяти последовательных кадров.

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по кривым интенсивности после фотообесцвечивания) в обоих каналах кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E app = I A / ( I A + I D ), где I A и I D представляют интенсивности акцептора и донора соответственно.Приложение E предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ 2 между двумя флуорофорами и необходимых инструментальных поправок. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ 2 близка к 2/3 34, 55 . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности регистрации между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI A к изменению интенсивности донора, ΔI D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI A IΔI Д ) 21, 56 .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около 57, 58 . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в окрестности 59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

  1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

  2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей донора и акцептора), всего I , должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

  3. Следует снимать длинные видеоролики, демонстрирующие одноэтапные события фотообесцвечивания, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

  4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) 62 - хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает только до уровня донора ( E app = 0), считайте, что он мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии подавителей мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения 28 .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о свойствах равновесия лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающей стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния 63 , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстры для надежных определение времени пребывания 64 .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки числа заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние 65 (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных до конечных значений FRET для каждого перехода, полученный из HMM (или другого) анализа, обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных 57, 65-67 .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном 68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный, визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом 71 .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения метода до того, как кто-то спроектирует первый эксперимент smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК 72, 73 и многих белков 74, 75 .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной маркировке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R 0 = 5 нм.Однако изменения расстояния всего лишь 0,3 нм могут быть обнаружены для одиночных молекул между 0,6 R 0 и 1,5 R 0 , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 5 фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 3 точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации 76 , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями 77, 78 . Опасения по поводу этих проблем можно было бы дополнительно уменьшить, используя избыточное количество ограничений расстояния в исследованиях триангуляции 79, 80 .

Усовершенствованные методы smFRET

Ниже кратко излагаются некоторые из новых интересных технических разработок, которые все еще находятся на стадии подтверждения принципа.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения неоднозначности. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных 43 .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами 81, 82 . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц 83, 84 недавно была расширена до трехцветной FRET 85 .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК 86 .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расшифровки флуоресценции одиночных молекул 87 и FRET 88 , чтобы сообщить о распаковке шпильки ДНК, вызванной силой.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК 89 . Совсем недавно отклик одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживался с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складывающегося ландшафта 90 . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина 91, 92 .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы по хорошо зарекомендовавшей себя системе smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще не разработаны, - это измерения в живой клетке, что, вероятно, требует значительных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, - это открыть глаза «одной молекуле» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования полиэтиленгликоля (PEG 9000) поверхности

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждения, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальными институтами здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

1. Фейнман Р.П. Внизу много места. J Microelectromech Syst. 1992; 1: 60–66. [Google Scholar] 2. Бустаманте С., Брайант З., Смит С.Б. Десять лет напряженности: механика одномолекулярной ДНК. Природа. 2003. 421: 423–427.[PubMed] [Google Scholar] 3. Моернер В.Е., Фромм Д.П. Методы флуоресцентной спектроскопии и микроскопии одиночных молекул. Rev Sci Inst. 2003. 74: 3597–3619. [Google Scholar] 4. Форстер Т. Экспериментальное и теоретическое исследование межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения. Zeitschrift Naturforsch A. 1949; 4: 321–327. [Google Scholar] 5. Ха Т. Одномолекулярный резонансный перенос энергии флуоресценции. Методы. 2001; 25: 78–86. [PubMed] [Google Scholar] 6. Вайс С. Флуоресцентная спектроскопия одиночных биомолекул.Наука. 1999; 283: 1676–1683. [PubMed] [Google Scholar] 7. Joo C, Ha T. In: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 3–36. [Google Scholar] 8. Ha T, et al. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: передача резонансной энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1996; 93: 6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9. Капанидис А.Н. и др.Переменное лазерное возбуждение одиночных молекул. Acc Chem Res. 2005; 38: 523–533. [PubMed] [Google Scholar] 10. Michalet X, Weiss S, Jager M. Одномолекулярные флуоресцентные исследования сворачивания белка и конформационной динамики. Chem Rev.2006; 106: 1785–1813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 11. Зайдель Р., Деккер С. Исследования одномолекулярных двигателей нуклеиновых кислот. Curr Opin Struct Biol. 2007; 17: 80–86. [PubMed] [Google Scholar] 12. Смайлик Р.Д., Хаммес Г.Г. Одномолекулярные исследования механизмов ферментов.Chem Rev.2006; 106: 3080–3094. [PubMed] [Google Scholar] 13. Zhuang XW. Одномолекулярная РНК-наука. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005. 34: 399–414. [PubMed] [Google Scholar] 14. Форстер Т. // Современная квантовая химия. О С, редактор. Академическая пресса; Нью-Йорк: 1967. С. 93–137. [Google Scholar] 16. Дениз А.А. и др. Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции на свободно диффундирующих молекулах: наблюдение зависимости Форстера от расстояния и субпопуляций. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 3670–3675.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17. Best RB, et al. Эффект гибкости и цис-остатков в исследованиях одномолекулярного FRET полипролина. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 18964–18969. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18. Торговец KA, Best RB, Louis JM, Gopich IV, Eaton WA. Характеристика развернутых состояний белков с помощью FRET-спектроскопии одиночных молекул и молекулярного моделирования. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 1528–1533. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20.Ha T, Chemla DS, Enderle T, Weiss S. Спектроскопия одиночных молекул с автоматическим позиционированием. App Phys Lett. 1997; 70: 782–784. [Google Scholar] 21. Sabanayagam CR, Eid JS, Meller A. Высокопроизводительный сканирующий конфокальный микроскоп для анализа отдельных молекул. App Phys Lett. 2004. 84: 1216–1218. [Google Scholar] 22. Чжуанг X и др. Одномолекулярное исследование катализа и сворачивания РНК. Наука. 2000; 288: 2048–2051. [PubMed] [Google Scholar] 23. Brasselet S, Peterman EJG, Miyawaki A, Moerner WE. Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночных молекул у камелеона, зависимого от концентрации кальция.J. Phys Chem B. 2000; 104: 3676–3682. [Google Scholar] 24. Hohng S, Ha T. Одномолекулярный квантово-точечный флуоресцентный резонансный перенос энергии. Chemphyschem. 2005; 6: 956–960. [PubMed] [Google Scholar] 25. Hohng S, Ha T. Почти полное подавление мерцания квантовых точек в условиях окружающей среды. J Am Chem Soc. 2004; 126: 1324–1325. [PubMed] [Google Scholar] 26. Капанидис А.Н., Вайс С. Флуоресцентные зонды и химия биоконъюгации для анализа флуоресценции одиночных молекул биомолекул. J Chem Phys. 2002; 117: 10953–10964.[Google Scholar] 27. Hubner CG, Renn A, Renge I, Wild UP. Прямое наблюдение тушения триплетного времени жизни одиночных молекул красителя молекулярным кислородом. J Chem Phys. 2001; 115: 9619–9622. [Google Scholar] 28. Расник И., МакКинни С.А., Ха Т. Немигающая и долговременная флуоресцентная визуализация одиночных молекул. Nat Meth. 2006; 3: 891–893. [PubMed] [Google Scholar] 29. Руст MJ, Bates M, Zhuang X. Получение изображений с субдифракционным пределом с помощью микроскопии стохастической оптической реконструкции (STORM) Nat Meth. 2006; 3: 793–795. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30.Виденгрен Дж., Чмыров А., Эггелинг С., Лофдаль П.А., Зайдель С. Стратегии повышения фотостабильности в сверхчувствительной флуоресцентной спектроскопии. J. Phys Chem A. 2007; 111: 429–440. [PubMed] [Google Scholar] 31. Бенеш Р.Е., Бенеш Р. Ферментативное удаление кислорода для полярографии и связанных с ней методов. Наука. 1953; 118: 447–448. [PubMed] [Google Scholar] 32. Aitken CE, Marshall RA, Puglisi J. Система поглощения кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул. Биофиз Дж.2007; 107: 117689. biophysj. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 33. Ву П.Г., Брэнд Л. Резонансная передача энергии - методы и приложения. Анальная биохимия. 1994; 218: 1–13. [PubMed] [Google Scholar] 34. Clegg RM. Флуоресцентный резонансный перенос энергии и нуклеиновые кислоты. Методы Энзимол. 1992; 211: 353–388. [PubMed] [Google Scholar] 35. Murphy MC, Rasnik I, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Исследование конформационной гибкости одноцепочечной ДНК с использованием флуоресцентной спектроскопии. Биофиз Дж. 2004; 86: 2530–2537. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 36.Рю Й.Х., Шульц П.Г. Эффективное включение неприродных аминокислот в белки Escherichia coli. Nat Meth. 2006; 3: 263–265. [PubMed] [Google Scholar] 37. Хигучи Р., Круммель Б., Сайки РК. Общий метод подготовки in vitro и специфический мутагенез фрагментов ДНК: изучение взаимодействия белков и ДНК. Nucleic Acids Res. 1988; 16: 7351–7367. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38. Браман Дж. Протоколы мутагенеза in vitro. 2-й. Vol. 182. Humana Press; Тотова, Нью-Джерси: 2001. [Google Scholar] 39.Pennington MW. Процедуры химической модификации для конкретных участков. Методы Мол биол. 1994; 35: 171–185. [PubMed] [Google Scholar] 40. Аксельрод Д. Неинвазивные методы в клеточной биологии. Вили-Лисс; Нью-Йорк: 1990. [Google Scholar] 41. Аксельрод Д. Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения в клеточной биологии. Методы Энзимол. 2003; 361: 1–33. [PubMed] [Google Scholar] 44. Ha T, et al. Инициирование и повторное инициирование раскручивания ДНК реп-геликазой Escherichia coli. Природа. 2002; 419: 638–641. [PubMed] [Google Scholar] 45.София С.Дж., Премнат В.В., Меррилл Е.В. Поли (этиленоксид), привитый к поверхности кремния: плотность прививки и адсорбция белка. Макромолекулы. 1998. 31: 5059–5070. [PubMed] [Google Scholar] 46. Шредер С.М., Блейни П.С., Ким С., Се XS. В: Методы одиночных молекул: лабораторное руководство. Селвин П., Ха Т, редакторы. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор; NY: 2007. С. 461–492. [Google Scholar] 47. Heyes CD, Кобицкий А.Ю., Амиргулова Е.В., Ниенхаус ГУ. Биосовместимые поверхности для специфического связывания отдельных белковых молекул.J. Phys Chem B. 2004; 108: 13387–13394. [Google Scholar] 48. Heyes CD, Groll J, Moller M, Nienhaus GU. Синтез, формирование рисунка и применение звездообразных биофункциональных поверхностей из полиэтиленгликоля. Mol BioSyst. 2007; 3: 419–430. [PubMed] [Google Scholar] 49. Ча Т, Го А, Чжу XY. Ферментативная активность на чипе: критическая роль ориентации белков. Протеомика. 2005; 5: 416–419. [PubMed] [Google Scholar] 51. Okumus B, Wilson TJ, Lilley DM, Ha T. Исследования инкапсуляции везикул показывают, что гетерогенность одиночных молекул рибозима является внутренней.Биофиз Дж. 2004; 87: 2798–2806. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 52. Бенитес Дж. Дж. И др. Исследование временных взаимодействий медных шаперонов и белков болезни Вильсона на уровне одной молекулы с захватом нанопузырьков. J Am Chem Soc. 2008; 130: 2446–2447. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 54. Myong S, Rasnik I., Joo C, Lohman TM, Ha T. Повторяющееся перемещение моторного белка на ДНК. Природа. 2005; 437: 1321–1325. [PubMed] [Google Scholar] 55. Ван дер Меер Б.В. Резонансная передача энергии.Wiley; Чичестер: 1999. [Google Scholar] 56. Ha T, et al. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия конформационной динамики и механизма расщепления ферментов. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1999; 96: 893–898. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 57. Джу С. и др. Наблюдение в реальном времени за динамикой волокна RecA с разрешением по одному мономеру. Клетка. 2006; 126: 515–527. [PubMed] [Google Scholar] 58. Ло Г, Ван М, Кенигсберг WH, Се XS. Одномолекулярные и ансамблевые флуоресцентные анализы функционально важных конформационных изменений в ДНК-полимеразе Т7.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2007; 104: 12610–12615. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 59. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Зечел А., Лилли Д.М. Наблюдение спиральной геометрии двухцепочечной ДНК в растворе с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1993; 90: 2994–2998. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 60. Купер Дж. П., Хагерман П. Дж. Анализ переноса энергии флуоресценции в дуплексных и разветвленных молекулах ДНК. Биохимия. 1990; 29: 9261–9268. [PubMed] [Google Scholar] 61.Ли С.П., Портер Д., Чирикджян Дж. Г., Кнутсон Дж. Р., Хан М.К. Флуорометрический анализ реакций расщепления ДНК, характеризуемых эндонуклеазой рестрикции BamHI. Анальная биохимия. 1994; 220: 377–383. [PubMed] [Google Scholar] 62. Ha TJ, et al. Временные колебания резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя красителями, конъюгированными с одним белком. Chem Phys. 1999; 247: 107–118. [Google Scholar] 63. Colquhoun D, ​​Hawkes AG. В: Одноканальная запись. Сакманн Б., Нехер Э., редакторы. Пленум Пресс; Нью-Йорк: 1995.С. 397–482. [Google Scholar] 64. Ким HD и др. Mg2 + -зависимые конформационные изменения РНК изучали с помощью корреляции флуоресценции и FRET на иммобилизованных одиночных молекулах. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 4284–4289. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 65. McKinney SA, Joo C, Ha T. Анализ траекторий FRET одиночных молекул с использованием скрытого марковского моделирования. Biophys J. 2006; 91: 1941–1951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 66. Манро Дж. Б., Альтман Р. Б., О'Коннор Н., Бланшар СК. Идентификация двух различных промежуточных продуктов гибридного состояния на рибосоме.Mol Cell. 2007. 25: 505–517. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 67. Myong S, Bruno MM, Pyle AM, Ha T. Пружинный механизм раскручивания ДНК геликазой NS3 вируса гепатита C. Наука. 2007; 317: 513–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 68. Ян Х, Се XS. Зондирование фотона динамики одной молекулы фотоном. J Chem Phys. 2002; 117: 10965–10979. [Google Scholar] 69. Андрек М, Леви Р.М., Талага Д.С. Прямое определение кинетических скоростей по траекториям прихода фотонов одной молекулы с использованием скрытых марковских моделей.J. Phys Chem A. 2003; 107: 7454–7464. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 70. Шредер Г.Ф., Грубмюллер Х. Траектории максимального правдоподобия из экспериментов по резонансному переносу энергии флуоресценции одиночных молекул. J Chem Phys. 2003; 119: 9920–9924. [Google Scholar] 71. Бланшар СК, Гонсалес Р.Л., Ким Х.Д., Чу С., Пуглиси ДжейДи. Отбор тРНК и кинетическая корректура при переводе. Nat Struct Mol Biol. 2004. 11: 1008–1014. [PubMed] [Google Scholar] 72. Смит Г.Дж., Сосник Т.Р., Шерер Н.Ф., Пан Т. Эффективное флуоресцентное мечение большой РНК посредством гибридизации олигонуклеотидов.РНК. 2005; 11: 234–239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 73. Dorywalska M, et al. Сайт-специфическая маркировка рибосомы для спектроскопии одиночных молекул. Nucleic Acids Res. 2005. 33: 182–189. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 74. Дениз А.А. и др. Сворачивание одномолекулярного белка: исследования диффузионного флуоресцентного резонансного переноса энергии денатурации ингибитора химотрипсина 2. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97: 5179-5184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 75. Ягер М, Нир Э, Вайс С.Сайт-специфическая маркировка белков для одномолекулярного FRET путем комбинирования химической и ферментативной модификации. Protein Sci. 2006. 15: 640–646. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 76. Дейл Р.Э., Эйзингер Дж., Блумберг В.Е. Ориентационная свобода молекулярных зондов - фактор ориентации во внутримолекулярной передаче энергии. Биофиз Дж. 1979; 26: 161–193. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 77. Schuler B, Lipman EA, Steinbach PJ, Kumke M, Eaton WA. Полипролин и «спектроскопическая линейка» заново с флуоресценцией одиночных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102: 2754–2759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 78. Ротвелл П.Дж. и др. Многопараметрическая флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул выявляет гетерогенность комплексов обратной транскриптазы ВИЧ-1: праймер / матрица. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 1655–1660. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 79. Rasnik I, Myong S, Cheng W, Lohman TM, Ha T. Ориентация связывания ДНК и конформация домена мономера реп-геликазы E. coli, связанного с частичным дуплексным соединением: исследования одной молекулы флуоресцентно меченых ферментов.J Mol Biol. 2004; 336: 395–408. [PubMed] [Google Scholar] 81. Кламм Дж. П., Дениз А. А.. Трехцветный резонансный перенос энергии флуоресценции одной молекулы. Chemphyschem. 2005; 6: 74–77. [PubMed] [Google Scholar] 82. Хайнце К.Г., Янц М., Швилле П. Анализ совпадений трех цветов: еще один шаг в изучении образования молекулярных комплексов более высокого порядка. Биофиз Дж. 2004; 86: 506–516. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 83. Капанидис А.Н. и др. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий с помощью переменного лазерного возбуждения отдельных молекул.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2004; 101: 8936–8941. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 85. Ли Н.К. и др. Трехцветное переменное лазерное возбуждение одиночных молекул: мониторинг множественных взаимодействий и расстояний. Биофиз Дж. 2007; 92: 303–312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 86. Heilemann M, et al. Многоступенчатая передача энергии в одиночных молекулярных фотонных проволоках. J Am Chem Soc. 2004; 126: 6514–6515. [PubMed] [Google Scholar] 87. Ланг М., Фордайс П., Энг А., Нойман К., Блок С. Комбинированная флуоресцентная и силовая микроскопия.Biophys J. 2003; 84: 301a – 301a. [Google Scholar] 88. Tarsa PB, et al. Обнаружение индуцированных силой молекулярных переходов с резонансным переносом энергии флуоресценции. Angew Chem Int Ed. 2007; 46: 1999–2001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 89. Шрофф Х. и др. Биосовместимый датчик силы с оптическим считыванием и размерами 6 нм (3) Nano Lett. 2005; 5: 1509–1514. [PubMed] [Google Scholar] 90. Hohng S, et al. Флуоресцентно-силовая спектроскопия отображает двумерный ландшафт реакций холлидея.Наука. 2007. 318: 279–283. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 92. Harms GS, et al. Зондирование конформационных изменений ионных каналов грамицидина с помощью флуоресцентной микроскопии с фиксацией одиночных молекул. Биофиз Дж. 2003; 85: 1826–1838. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 93. Tan E, et al. Четырехстороннее соединение ускоряет складывание шпилечного рибозима через дискретное промежуточное соединение. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 9308–9313. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 94. Haugland R. Справочник по флуоресцентным датчикам и исследовательским продуктам.9-е. Молекулярные зонды; Юджин, штат Орегон: 2002. [Google Scholar] 95. Jager M, Michalet X, Weiss S. Белковые взаимодействия как инструмент для сайт-специфической маркировки белков. Protein Sci. 2005. 14: 2059–2068. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 96. Ратнер В., Кахана Е., Эйхлер М., Хаас Э. Общая стратегия сайт-специфичного двойного мечения глобулярных белков для кинетических исследований FRET. Bioconjug Chem. 2002; 13: 1163–1170. [PubMed] [Google Scholar]

Black Fret Artist - обладательница крупного гранта 2016 Венди Колонна

Выступление на Black Fret Black Ball 2016

10 декабря мне выпала честь быть среди 10 артистов из Остина, получивших грант в размере 17 000 долларов США от Black Fret, потрясающая музыкальная некоммерческая организация из Остина, финансируемая спонсорами.Еще 10 художников, которые были номинантами в 2016 году, также были награждены 5000 долларов и имеют право на вторую номинацию в 2017 году. В 2016 году номинантами были Bee Caves, Карсон МакХоун, Дэн Дайер, Накия, Рэй Прим, Сюзанна Чоффель, «Плавание с медведями», The Peterson Brothers. , Walker Lukens, Brownout, Calliope Musicals, Dana Falconberry, Daniel Eyes & The Vibes, Golden Dawn Arkestra, Harvest Thieves, Leopold and His Fiction, Magna Carda, Sweet Spirit и The Name Sayers.

Святая корова.

После 20 лет работы в этом бизнесе, 17 лет в Остине и множества взлетов и падений в моей карьере, я просто потрясен. Во-первых, когда я подписал контракт в 19 лет, бизнес строился на рекордных продажах в качестве финансовой основы. Это ушел по пути дронта. Музыка бесплатна, но по-прежнему требует больших затрат в производстве и еще более затратных для продажи.

Поскольку записанная музыка упала в денежном выражении, артисты, подобные мне, проводят много времени в турах, продавая другие товары и впечатления (например, кампания на моей странице PledgeMusic, созданная для финансирования выпуска моего нового альбома в апреле 2017 года).Мы также в конечном итоге реинвестируем около 65-70% нашего дохода в наш бизнес, чтобы поддерживать работу. Мы срезали углы, как будто я два года был без дома, или жил в фургоне, или с полудюжиной соседей по комнате. Мы заставляем это работать.

Получение гранта на Black Fret Black Ball 2016

Хотя я гастролировал 20 лет и у меня было много удивительных и значимых возможностей для роста и поддержания себя как артиста, я также не видел ни одного из этих фантастических «Разрывы», о которых говорят люди.На протяжении многих лет я получал бесчисленное количество сообщений и слышал от тысяч поклонников, которые от всего сердца делятся тем, что музыка обогащает их жизнь. Это заставило меня пережить самые тяжелые времена. Хотя мой последний альбом Nectar и реклама Coca-Cola, которую я написал, открыли мою музыку для многих новых людей, у нас была большая пресса, в следующем году я не стал значительно богаче. Может быть, такие причудливые, мифические «перерывы» тоже остались в прошлом. Многие из моих друзей, у которых были контракты с мейджор-лейблами, были замечены на певческих реалити-шоу и даже у таких музыкантов, как Def Leppard, Macy Grey и Melissa Etheridge, которые выиграли ОГРОМНУЮ Грэмми, проводят краудфандинговые кампании PledgeMusic, как маленький старый я.

Понятие свободы музыки для потребителей одинаково для всех нас.

Несмотря на цифры, мы все должны выглядеть привлекательно для публики, чтобы чувствовать, что мы делаем что-то необычное. Но большинство из нас, в том числе перечисленные выше великие люди, смотрят на аналогичные цифры и задаются вопросом, как мы сможем позволить своей следующей песне тронуть сердца слушателей или добраться до следующего города и покрыть гостиничные номера, производство и маркетинг.

И мы все еще делаем все возможное для музыки.

2016 Black Fret

Black Fret предлагает нечто иное. Участники номинируют музыкантов, которые охватывают все жанры - людей, играющих все, от хард-рока до хип-хопа, соула и блюза, до авторов-исполнителей и безумно оркестрованного психоделического рока с гимном. Они любят музыку. Они посещают шоу, которые курирует сообщество в течение года, и голосуют за своих фаворитов, чтобы получить грант за их тяжелую работу и музыкальное мастерство. Они гордятся своими группами, которые продолжают делать удивительные вещи на свои гранты.

Группы, получившие гранты, покупают более безопасные туристические фургоны, они снимают музыкальные клипы, нанимают публицистов, они совершают поездку по новым местам с меньшим риском, они могут легче дышать и время от времени спать в отеле в дороге (вместо своих фургон или фан-кушетка напольная). Их карьера заметно улучшается благодаря грантам, большим и малым.

Гранты не выдаются отобранным артистам единовременно. Black Fret считает, что выбранные ими артисты обогатят их карьеру, «разблокируя» их гранты в рассрочку.Следующий год своей карьеры я потрачу на постепенное получение гранта путем выполнения, записи, написания и выполнения работ по оказанию помощи другим некоммерческим организациям. Каждая из этих задач открывает определенную сумму в долларах.

Кроме того, номинанты и получатели грантов имеют доступ к сообществу профессионалов музыкального бизнеса, которые будут сидеть с ними и помогать им разрабатывать стратегии, позволяющие разумно распоряжаться своим временем, деньгами и талантами. Среди этих профессионалов - производители, инженеры мирового класса, публицисты, специалисты по лицензированию, агенты по бронированию, юристы и многие другие.Этот консультативный совет УДИВИТЕЛЬНЫЙ. За последние шесть месяцев я встретился примерно с 16 из 38 консультантов, и мне очень понравилась каждая минута времени, которое я потратил на обучение у них.

Black Fret готов расшириться до других городов. Следующими они ищут Денвер и Нэшвилл. Ага!

Лично я чертовски взволнован.

Хотите узнать больше об этой удивительной организации? Хочу присоединиться? Хотите привнести Black Fret в свой музыкальный город? Посетите их новый крутой сайт www.blackfret.org, чтобы узнать больше!

Вот статья из Forbes о Black Fret.

Вот замечательная статья в Austin Chronicle о многих некоммерческих организациях Остина, связанных с прекрасной музыкой!

Вот статья, недавно написанная журналом Pitchfork Magazine, в которой более подробно описывается домен .org.

Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist Black Fret Artist

Обзор Black Fret | Музыкальный журнал Lone Star

Ричард Сканс

(LSM июль / август 2014 г. / том 7 - выпуск 4)

Раннее воскресенье - например, раньше полудня - может показаться странным временем для созыва собрания музыкальных исполнителей и профессионалов.Но тот факт, что некоторые из самых известных и опытных закулисных музыкантов Остина и многие из самых ярких и многообещающих талантов собрались утром 22 июня в доме Колина Кендрика, основателя группы non -прибыльный Black Fret был свидетельством того, насколько все они верят в дело сохранения наследия Остина как одного из лучших музыкальных городов в мире.

Дэвис Макларти и Дэнни Мэлоун (Фото Эми Прайс)

«Миссия Black Fret - помочь нашим музыкантам создавать и исполнять отличную новую музыку», - объясняет Кендрик, адаптировавший модель Black Fret из вековой традиции меценатства частным искусствам.Каждый год общественная благотворительная организация будет предоставлять гранты в размере 10 000 долларов 10 различным музыкальным артистам или группам Остина по выбору покровителей, которые приобрели членство в Black Fret на 1 500 долларов. Члены также голосуют за первых 20 номинантов, участвующих в конкурсе на получение грантов, и могут посещать частные концерты и другие мероприятия Black Fret в течение года. Тем временем всем кандидатам на гранты разрешается назначать встречи наставников / подопечных с консультативным советом Black Fret, выдающимся сообществом профессионалов отрасли, включая продюсеров, владельцев студий, менеджеров, агентов по бронированию, промоутеров на радио и юристов в сфере развлечений.

Хизер Вагнер-Рид с Доун и Хоукс (фото Эми Прайс)

Цель воскресного собрания в июне состояла в том, чтобы позволить артистам, номинированным в этом году, - Эми Кук, Дэнни Мэлоун, Dawn & Hawkes, East Cameron Folkcore, Элиасу Хаслангеру и Черчу в понедельник, Элизабет МакКуин, Эмили Белл, Эрин Айви, Джине. Чавес, Грэм Уилкинсон, Джиттербаг Гадюки, Джонни Грей, Линкольн Дарем, Литтл Радар, Мать Сокол, Тихая компания, Ракетные парни, Сестры Виски, Дикий ребенок и Зил - возможность представиться консультативному совету.Артисты и «наставники» общались друг с другом один на один по несколько минут, «в стиле скоростных свиданий», а затем по очереди менялись, чтобы у всех была возможность встретиться.

«Это был первый раз, когда все наставники собрались вместе с группой», - сказала член консультативного совета Хизер Вагнер Рид, президент и основатель Juice Consulting, находящейся в Остине фирмы по связям с общественностью, маркетингу и развитию артистов. «Я не знаю, знал ли кто-нибудь, чего ожидать, но после этого мы все были потрясены.Было просто вдохновляюще видеть энергию в комнате и то, какое взаимодействие эти художники и консультанты имели вместе ».

Помимо Вагнера Рида, остальные из только что объявленных членов консультативного совета Black Fret (не все из которых смогли присутствовать на первоначальной встрече и приветствии): Марк Аддисон, Роджи Баер, Майк Кроули, Си Джей Эйркссон, Дженни Финли, Уилл Хоффман, Террани Джонсон, Терри Ликона, Уэстон Макгоуэн, Дэвис Макларти, Мэтт Новески, Тим Палмер, Питер Шварц, Карлос Соса, Джо Сталлоне, Стюарт Салливан, Майк Суинфорд, Кевин Уоммак и Том Вейл.

В дальнейшем художники и члены консультативного совета будут организовывать дополнительные встречи наставников друг с другом, если это позволяет их график. У номинантов также будет возможность выступать перед участниками Black Fret на регулярных мероприятиях в течение остальной части летнего и осеннего «периода прослушивания». Все это приводит к первому ежегодному Черному балу, на котором будут объявлены 10 победителей гранта. Гала-концерт состоится в ноябре, место и дата проведения будут объявлены дополнительно.

После сбора 1 доллара.75M для музыкантов из Остина, Black Fret надеется сохранить музыку в Сиэтле.

Лондон называет нынешнюю ситуацию «идеальным экономическим штормом», который произошел из-за того, что рост стоимости жизни в Сиэтле начался одновременно с «демонетизацией музыки». . » Тенденция к «бесплатному» стримингу обходится дорого, и даже живые выступления не меняют разницы. Лондон играл в группах Сиэтла последние три десятилетия, в том числе в Alcohol Funnycar и Stag, но, по его словам, популярность в местных клубах не выросла.«Чтобы увидеть большинство местных групп в клубах Сиэтла в течение 25 лет, нужно было 8 долларов, - говорит он.

Эд Бисон тоже знает эту математику, как бывший владелец клуба (Backstage в Балларде), менеджер группы, а теперь и Gigs4U, который доставляет музыку в международный аэропорт Сиэтл-Такома и другие места в Сиэтле. «Модель финансирования Black Fret будет иметь большое значение для начинающих художников», - говорит Бисон. «Но я также думаю, что существует большая потребность в местной ассоциации музыкального бизнеса, которая могла бы обслуживать музыкантов и такие предприятия, как студии, концертные площадки, розничных продавцов и преподавателей.Это действительно проблема экономического развития ».

Отчет за 2016 год показал, что музыкальная экономика Сиэтла - это индустрия с оборотом 1,8 миллиарда долларов, в которой непосредственно занято более 16 000 человек. И все же средний доход работающих музыкантов в Сиэтле составляет 15 000 долларов в год. (Средний доход среднего работника в районе Сиэтла составлял 49 618 долларов в 2018 г.)

Шумиха вокруг Грэмми, вероятно, поднимет национальную прессу о том, что доходы от музыки в целом растут после десятилетий спада - общие продажи записанной музыки выросли на 10% в 2018 году , а виниловые диски сейчас продаются больше, чем компакт-диски.Но эти цифры не принимают во внимание тот факт, что даже когда вы транслируете мощный хит Брэнди Карлайл «Шутка», Spotify или YouTube сначала платят звукозаписывающим компаниям или музыкальным издателям, прежде чем что-либо достанется музыкантам. В прошлом месяце автор песен из Нэшвилла Десмонд Чайлд сообщил, что его вырезка из половины миллиардов стримов за последний год мегахита «Livin 'on a Prayer», написанного им в соавторстве с Бон Джови, стоила всего 6000 долларов.

Эта некоммерческая организация в Остине меняет способ оплаты труда местных музыкантов

Зимой 2012 года Мэтт Отт и Колин Кендрик собрались на заднем дворе Южного Остина с несколькими местными музыкантами и задали простой вопрос: какие ресурсы действительно изменят игру для городской цитадели начинающих художников? Хотя коренные остинцы и друзья детства сами не музыканты (Отт работает в компании-разработчике программного обеспечения Personify, Кендрик - в компании SunPower, занимающейся солнечной энергией), они десятилетиями участвовали в местной музыкальной жизни, основав (вместе с Никки) Роулинг) Музыкальный фонд Остина десятью годами ранее.

«Это был просто откровенный разговор о том, где каждый из нас был», - вспоминает певица и автор песен Джина Чавес. «Кому-то нужен туристический фургон, кому-то нужна реклама, кому-то нужно оборудование - от 10 до 20 тысяч долларов - вот такие цифры, о которых говорят».

В результате этого собрания и бесчисленных подобных разговоров в конечном итоге возникла Black Fret, общественная благотворительная организация 501 (c) (3), которая все больше и больше вызывает волну в музыкальном сообществе Остина из-за того, как она поддерживает местные таланты.Всего за несколько коротких лет Black Fret передали более 280 000 долларов напрямую артистам Остина, в том числе восходящим звездам Шеки Грейвс, Дане Фалконберри и Wild Child. Позже на этой неделе, на своем ежегодном Черном балу, организация объявит о грантах на сумму более 200 000 долларов - более 5000 долларов для малых грантов и 10 000 долларов для крупных, - которые Black Fret предоставит более чем дюжине местных музыкантов в течение 2017 года. доступ к сети консультантов - большой плюс для города, который, хотя и известен как мировая столица живой музыки, «не имеет инфраструктуры музыкальной индустрии профессионального уровня», - говорит Чавес.

То, как эти артисты собирают гранты, является частью того, что отличает организацию от других и, как надеются Отт и Кендрик, будущей моделью для других центров живой музыки по всей Америке. Музыканты должны «разблокировать» его через ряд этапов карьеры: гастроли за пределами Остина (каждое выступление приносит им 250 долларов), запись музыки (1000 долларов за песню, которые постепенно награждаются на протяжении всего процесса написания и записи) и игры для других местных некоммерческих организаций (1000 долларов США). ).

Откуда берутся эти деньги, перекликается с давно установившейся системой патронажа изобразительного искусства, когда 350 покровителей Black Fret платят ежегодный членский взнос в размере 1500 долларов.Взамен они могут посещать местные шоу с участием артистов Black Fret. «Музыка заслуживает поддержки общества, так же как опера, симфония и балет поддерживались на протяжении сотен лет», - говорит Отт.

«Когда я услышал, что некоторые группы в городе получают гранты в год, когда он начался, я подумал, что каким-то волшебным образом город решил предоставить гранты», - говорит Сабрина Эллис, чья хриплая группа Sweet Spirit из девяти человек получит грант на этом мероприятии. черный шар года. «Это действительно хорошо для пожилых, более стабильных в финансовом отношении людей.Деньги определенно поступают от желания финансировать музыку и немного повеселиться ».

В Остине, конечно же, есть и другие некоммерческие организации, занимающиеся музыкой, от заботящихся о здоровье (SIMS Foundation для служб психического здоровья музыкантов, Health Alliance for Austin Musicians) до более общей поддержки (Austin Music People, Ott and Собственный Austin Music Foundation Кендрика). Но это не меняет того факта, что, согласно опросу 2380 местных музыкантов, проведенному городом в 2015 году, 20 процентов музыкантов в Остине живут за чертой бедности, а 30 процентов - чуть выше нее.Многие из музыкантов Black Fret, с которыми я разговаривал, ссылались на повседневную работу, а также на проблемы, возникающие из-за двойного - и часто противоречивого - стремления творить искусство и зарабатывать на жизнь в быстро развивающемся городе.

Связывание флуоресцентного лиганда с временным разрешением для рецепторов, связанных с G-белком.

  • 1

    Lundstrom, K. Структурная геномика GPCR. Trends Biotechnol. 23 , 103–108 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 2

    Overington, J.П., Аль-Лазикани, Б. и Хопкинс, А.Л. Сколько лекарств-мишеней существует? Nat. Rev. Drug Discov. 5 , 993–996 (2006).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 3

    Раск-Андерсен, М., Алмен, М.С. И Schioth, H.B. Тенденции использования новых мишеней для наркотиков. Nat. Rev. Drug Discov. 10 , 579–590 (2011).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 4

    Бьярнадоттир, Т.K. et al. Комплексный репертуар и филогенетический анализ рецепторов, связанных с G-белком, у человека и мыши. Genomics 88 , 263–273 (2006).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 5

    Foord, S.M. и другие. Международный союз фармакологии. XLVI. Список рецепторов, связанных с G-белком. Pharmacol Rev. 57 , 279–288 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 6

    Лагерстрем, М.C. & Schioth, H.B. Структурное разнообразие рецепторов, связанных с G-белком, и значение для открытия лекарств. Nat. Rev. Drug Discov. 7 , 339–357 (2008).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 7

    Пин, Дж. П. и Ахер, Ф. Метаботропные рецепторы глутамата: структура, механизм активации и фармакология. Curr. Наркотики нацелены на нейрол ЦНС. Disord. 1 , 297–317 (2002).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 8

    Лефковиц, Р.J. Исторический обзор: краткая история и личная ретроспектива семи трансмембранных рецепторов. Trends Pharmacol. Sci. 25 , 413–422 (2004).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 9

    May, L.T. & Christopoulos, A. Аллостерические модуляторы рецепторов, связанных с G-белком. Curr. Opin. Pharmacol. 3 , 551–556 (2003).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 10

    Бердсолл, Н.J. Гетеродимеры GPCR класса A: данные исследований связывания. Trends Pharmacol. Sci. 31 , 499–508 (2010).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 11

    Christopoulos, A. & Kenakin, T. Аллостеризм и комплексообразование рецепторов, связанных с G белком. Pharmacol. Ред. 54 , 323–374 (2002).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 12

    Хойер, Д., Schoeffter, P., Waeber, C. & Palacios, J.M. Серотониновые рецепторы 5-HT1D. Ann. N Y Acad. Sci. 600 , 168–181 (1990).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 13

    Паласиос, Дж. М., Менгод, Г., Виларо, М. Т. И Рамм, П. Последние тенденции в методах и инструментах анализа рецепторов. J. Chem. Нейроанат. 4 , 343–353 (1991).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 14

    Амента, Ф., Ферранте, Ф. и Риччи, А. Фармакологическая характеристика и авторадиографическая локализация подтипов дофаминовых рецепторов в сердечно-сосудистой системе и в почках. Hypertens Res. 18 (добавление 1), S23 – S27 (1995).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 15

    Katugampola, S.D., Kuc, R.E., Maguire, J.J. & Давенпорт, A.P. G-белок-сопряженные рецепторы при атеросклерозе человека: сравнение вазоконстрикторов (эндотелин и тромбоксан) с недавно деорфанизированными (уротензин-II, апелин и грелин) рецепторами. Clin. Sci. (Лондон) 103 (доп. 48), 171S – 175S (2002) .10.1042 / CS103S171S

    CAS Статья Google Scholar

  • 16

    Lohse, M.J., Nuber, S. & Hoffmann, C. Методы резонансного переноса энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками. Pharmacol. Ред. 64 , 299–336 (2012).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 17

    Селвин, П.R. Принципы и биофизические применения зондов на основе лантаноидов. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31 , 275–302 (2002).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 18

    Degorce, F. et al. HTRF: технология, разработанная для открытия лекарств - обзор теоретических аспектов и недавних приложений. Curr. Chem. Genomics 3 , 22–32 (2009).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 19

    Förster, T.Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Phys. (Лейпциг) 2 , 55–75 (1948).

    Артикул Google Scholar

  • 20

    Handl, H.L. & Gillies, R.J. Люминесцентные анализы на основе лантаноидов для взаимодействия лиганд-рецептор. Life Sci. 77 , 361–371 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 21

    Ху, Л.А., Чжоу, Т., Хамман, Б.Д. И Лю, К. Анализ связывания гомогенного G-белка с рецептором и лигандом, основанный на резонансном переносе энергии флуоресценции с временным разрешением. Assay Drug Dev. Technol. 6 , 543–550 (2008).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 22

    Albizu, L. et al. На пути к эффективному скринингу лекарственных средств с помощью гомогенных анализов, основанных на разработке новых флуоресцентных лигандов рецепторов вазопрессина и окситоцина. J. Med. Chem. 50 , 4976–4985 (2007).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 23

    Zwier, J.M. et al. Альтернатива связывания флуоресцентного лиганда с использованием технологии Tag-lite. J. Biomol. Экран 15 , 1248–1259 (2010).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 24

    Leyris, J.P. et al. Однородный флуоресцентный анализ с временным разрешением для скрининга лигандов, нацеленных на рецептор стимулятора секреции гормона роста типа 1a. Анал. Biochem. 408 , 253–262 (2011).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 25

    Inglese, J. et al. Взаимодействия хемокиновый рецептор-лиганд измеряли с помощью флуоресценции с временным разрешением. Биохимия 37 , 2372–2377 (1998).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 26

    Gao, X. et al. Меченые европием аналоги меланин-концентрирующего гормона: лиганды для измерения связывания с рецепторами 1 и 2 меланин-концентрирующего гормона. Анал. Biochem. 328 , 187–195 (2004).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 27

    Carter, P.H. и другие. Фотохимически усиленное связывание малых молекул с рецептором-1 фактора некроза опухоли ингибирует связывание TNF-альфа. Proc. Natl. Акад. Sci. США 98 , 11879–11884 (2001).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 28

    Мазор, О.и другие. Меченый европием эпидермальный фактор роста и нейротензин: новые зонды для исследований связывания рецепторов. Анал. Biochem. 301 , 75–81 (2002).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 29

    Takeuchi, T., Nishikawa, T., Matsukawa, R. & Matsui, J. Анализ неизотопных рецепторов для бензодиазепиновых препаратов с использованием флуорометрии с временным разрешением. Анал. Chem. 67 , 2655–2658 (1995).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 30

    Ручка, H.Л., Вагнер, Дж., Ямамура, Х.И., Хруби, В.Дж. И Гиллис, Р.Дж. Флуоресценция с временным разрешением на основе лантанидов во взаимодействиях лиганд-рецептор цито . Анал. Biochem. 330 , 242–250 (2004).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 31

    Maurel, D. et al. Обнаружение взаимодействия мембранных белков на клеточной поверхности с помощью технологии гомогенной флуоресцентной резонансной передачи энергии с временным разрешением. Анал.Biochem. 329 , 253–262 (2004).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 32

    Kern, A., Albarran-Zeckler, R., Walsh, H.E. И Смит, Р. Рецептор апо-грелина образует гетеромеры с DRD2 в нейронах гипоталамуса и необходим для анорексигенных эффектов агонизма DRD2. Нейрон 73 , 317–332 (2012).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 33

    Котте, А.& Контос, Т. Спиновый квантовый бит с ферромагнитными контактами для схемы QED. Phys. Rev. Lett. 105 , 160502 (2010).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 34

    Jares-Erijman, E.A. И Джовин, Т. FRET визуализация. Nat. Biotechnol. 21 , 1387–1395 (2003).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 35

    Мияваки, А.Разработка зондов для клеточных функций с использованием флуоресцентных белков и резонансного переноса энергии флуоресценции. Annu. Rev. Biochem. 80 , 357–373 (2011).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 36

    Börner, S. et al. FRET измерения внутриклеточных концентраций цАМФ и проницаемости аналога цАМФ в интактных клетках. Nat. Protoc. 6 , 427–438 (2011).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 37

    Baker, J.G. и другие. Синтез и характеристика высокоаффинных 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен-меченых флуоресцентных лигандов для β-адренорецепторов человека. J. Med. Chem. 54 , 6874–6887 (2011).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 38

    Номура, W.и другие. Мечение флуорофором позволяет визуализировать и оценивать специфическое взаимодействие CXCR4-лиганд на клеточной мембране для скрининга на основе флуоресценции. Биоконъюг. Chem. 19 , 1917–1920 (2008).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 39

    Кечскес, М., Кумар, Т.С., Ю, Л., Гао, З.Г. И Якобсон, К. Новый антагонист аденозинового рецептора A (2A), меченный Alexa Fluor-488: применение к анализу связывания рецептора на основе флуоресцентной поляризации. Biochem. Pharmacol. 80 , 506–511 (2010).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 40

    Козьма Э. и др. Новый флуоресцентный антагонист в качестве молекулярного зонда в анализах связывания аденозинового рецептора A3 с использованием проточной цитометрии. Biochem. Pharmacol. 83 , 1552–1561 (2012).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 41

    Слеттен, Э.М. и Бертоцци, C.R. Биоортогональная химия: ловля селективности в море функциональности. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 48 , 6974–6998 (2009).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 42

    Дейли, К.Дж. и МакГрат, Дж. К. Флуоресцентные лиганды, антитела и белки для исследования рецепторов. Pharmacol. Ther. 100 , 101–118 (2003).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 43

    Базин, Х., Trinquet, E. & Mathis, G. Амплификация испускания криптата с временным разрешением: универсальная технология для отслеживания биомолекулярных взаимодействий. J. Biotechnol. 82 , 233–250 (2002).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 44

    Альфа, Б., Лен, Дж. М. и Матис, Г. Люминесценция с переносом энергии криптатов европия (iii) и тербия (iii) макробициклических полипиридиновых лигандов. Angew. Chem. Int. Редактировать. 26 , 266–267 (1987).

    Артикул Google Scholar

  • 45

    Кобылка, Б.К. Структура и активация рецепторов, связанных с G-белками. Biochim. Биофиз. Acta. 1768 , 794–807 (2007).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 46

    Кастро, М., Николаев, В.О., Палм, Д., Лозе, М.Дж. и Вилардага, Дж. П. Включение рецептора паратироидного гормона с помощью двухступенчатого механизма связывания паратироидного гормона. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102 , 16084–16089 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 47

    Hoffmann, C. et al. Подход FRET на основе FlAsH для определения активации рецепторов, связанных с G-белками, в живых клетках. Nat. Методы 2 , 171–176 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 48

    Маурель, Д.и другие. Анализ взаимодействия белок-белок на поверхности клетки с помощью технологий FRET и snap-tag с временным разрешением: приложение к олигомеризации GPCR. Nat. Методы 5 , 561–567 (2008).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 49

    Keppler, A. et al. Общий метод ковалентного мечения гибридных белков малыми молекулами in vivo . Nat. Biotechnol. 21 , 86–89 (2003).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 50

    Albizu, L. et al. Разрешенная во времени FRET между лигандами GPCR выявляет олигомеры в нативных тканях. Nat. Chem. Биол. 6 , 587–594 (2010).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 51

    Weiland, G.A. И Молинофф, П.Количественный анализ взаимодействий лекарство-рецептор: I. Определение кинетических и равновесных свойств. Life Sci. 29 , 313–330 (1981).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 52

    Lohse, M.J. et al. 8-Циклопентил-1,3-дипропилксантин (DPCPX) - селективный высокоаффинный радиолиганд антагониста аденозиновых рецепторов A1. Наунин. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 336 , 204–210 (1987).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 53

    Klotz, K.N. и другие. 2-Хлор-N6- [3H] циклопентиладенозин ([3H] CCPA) - высокоаффинный радиолиганд агониста аденозиновых рецепторов A1. Наунин. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 340 , 679–683 (1989).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 54

    Вебер, Р.Г., Джонс, К.Р., Лозе, М.Дж. и Паласиос, Дж.М. Авторадиографическая визуализация аденозиновых рецепторов A1 в головном мозге крысы с использованием 3H 8-циклопентил-1,3-дипропилксантина. J. Neurochem. 54 , 1344–1353 (1990).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 55

    Абу-Самра, А.Б. и другие. Клонирование экспрессии общего рецептора паратироидного гормона и связанного с паратироидным гормоном пептида из остеобластоподобных клеток крысы: единственный рецептор стимулирует внутриклеточное накопление как цАМФ, так и трифосфатов инозита и увеличивает внутриклеточный свободный кальций. Proc. Natl. Акад. Sci. США 89 , 2732–2736 (1992).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 56

    Raisz, LG, Lorenzo, J., Gworek, S., Kream, B. & Rosenblatt, M. Сравнение эффектов мощного синтетического аналога бычьего паратиреоидного гормона с нативным bPTH- (1–84) и синтетический bPTH- (1–34) на резорбцию костей и синтез коллагена. Calcif. Tissue Int. 29 , 215–218 (1979).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 57

    Rosenblatt, M. & Potts, J.T. Jr. Разработка и синтез аналогов паратироидного гормона с повышенной биологической активностью. Endocr. Res. Commun. 4 , 115–133 (1977).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 58

    Пиошак, А.А. И Сюй, Е. Молекулярное распознавание паратироидного гормона его рецептором, связанным с G-белком. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105 , 5034–5039 (2008).

    Артикул Google Scholar

  • 59

    Jin, L. et al. Кристаллическая структура гормона паращитовидной железы человека 1–34 с разрешением 0,9-A. J. Biol. Chem. 275 , 27238–27244 (2000).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 60

    Potts, J.T. Гормон паращитовидной железы: прошлое и настоящее. J. Endocrinol. 187 , 311–325 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 61

    Xu, J. et al. Октадентатные клетки 2-гидроксиизофталамидов Tb (III): новый стандарт для люминесцентных этикеток из лантаноидов. J. Am. Chem. Soc. 133 , 19900–19910 (2011).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 62

    Купчо, К.R. et al. Одновременный мониторинг дискретных событий связывания с использованием двойного акцептора LRET на основе тербия. J. Am. Chem. Soc. 129 , 13372–13373 (2007).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 63

    Дин, Т., Вилардага, Дж. П., Поттс, Дж. Т. Младший и Гарделла Т.Дж. Измененная селективность паратироидного гормона (PTH) и PTH-родственного белка (PTHrP) в отношении различных конформаций рецептора PTH / PTHrP. Мол. Эндокринол. 22 , 156–166 (2008).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 64

    Вилардага, Дж. П., Бунеманн, М., Кразель, К., Кастро, М. и Лозе, М. Дж. Измерение миллисекундного переключателя активации рецепторов, связанных с G-белком, в живых клетках. Nat. Biotechnol. 21 , 807–812 (2003).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 65

    Зайферт, Р., Венцель-Зайферт, К., Гетер, У. и Кобилка, Б.К. Функциональные различия между полными и частичными агонистами: доказательства конформации лиганд-специфических рецепторов. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 , 1218–1226 (2001).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 66

    Lee, C. et al. Роль внеклеточных областей паратироидного гормона (ПТГ) / рецептора родственного ПТГ пептида в связывании гормона. Эндокринология 135 , 1488–1495 (1994).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 67

    McGrath, J.C., Arribas, S. & Daly, C.J. Флуоресцентные лиганды для исследования рецепторов. Trends Pharmacol. Sci. 17 , 393–399 (1996).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 68

    Дейли, С.Дж. и др. Связывание флуоресцентного лиганда показывает неоднородное распределение адренорецепторов и «каннабиноидоподобных» рецепторов в мелких артериях. Br. J. Pharmacol. 159 , 787–796 (2010).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 69

    Леа В.А. и Симеонов А. Анализ поляризации флуоресценции при скрининге малых молекул. Эксперт. Opin. Drug Discov. 6 , 17–32 (2011).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 70

    де Йонг, Л.А., Угес Д. Р., Франке Дж. П. и Бишофф Р. Анализы связывания рецептор-лиганд: технологии и приложения. J. Chromatogr. Б Аналит. Technol. Биомед. Life Sci. 829 , 1–25 (2005).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 71

    Gagne, A., Banks, P. & Hurt, S.D. Использование детектирования поляризации флуоресценции для измерения связывания флуопептида TM с рецепторами, связанными с G-белком. J. Recept.Сигнал Transduct. Res. 22 , 333–343 (2002).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 72

    Briddon, S.J. И Хилл, С.Дж. Фармакология под микроскопом: использование флуоресцентной корреляционной спектроскопии для определения свойств комплексов лиганд-рецептор. Trends Pharmacol. Sci. 28 , 637–645 (2007).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 73

    Роуз, Р.Х., Бриддон, С.Дж. И Хилл, С.Дж. Новый флуоресцентный антагонист гистаминового рецептора h2 демонстрирует преимущество использования флуоресцентной корреляционной спектроскопии для изучения связывания липофильных лигандов. Br. J. Pharmacol. 165 , 1789–1800 (2012).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 74

    Kumar, S. et al. Технология FLIM FRET для открытия лекарств: автоматизированный многолуночный анализ с высоким содержанием, мультиплексированные считывания и приложение in situ . Chemphyschem 12 , 609–626 (2011).

    Артикул CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  • 75

    Waller, A. et al. Методы: сборка GPCR, фармакология и скрининг с помощью проточной цитометрии. Trends Pharmacol. Sci. 25 , 663–669 (2004).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 76

    Дикер, Ф., Quitterer, U., Winstel, R., Honold, K. & Lohse, M.J. Не зависящее от фосфорилирования ингибирование передачи сигналов рецептора паратироидного гормона с помощью G-протеин-связанных рецепторных киназ. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96 , 5476–5481 (1999).

    Артикул CAS Google Scholar

  • 77

    Motulsky, H.J. & Neubig, R.R. Анализ данных связывания. Curr. Protoc. Neurosci. 52, 7.5.1–7.5.65 (2010). 10.1002 / 0471142301.ns0705s52

  • 78

    Motulsky, H.J. & Christopoulos, A. Подгонка моделей к биологическим данным с использованием линейной и нелинейной регрессии - практическое руководство по подгонке кривой. Программное обеспечение Graphpad (2003 г.).

  • 79

    Lohse, M.J., Lenschow, V. & Schwabe, U. Два состояния сродства рецепторов аденозина Ri в мембранах мозга. Анализ влияния гуаниновых нуклеотидов и температуры на связывание радиолигандов. Мол. Pharmacol. 26 , 1–9 (1984).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 80

    Де Лин, А., Хэнкок, А.А. И Лефковиц, Р.Дж. Проверка и статистический анализ метода компьютерного моделирования для количественного анализа данных о связывании радиолигандов для смесей подтипов фармакологических рецепторов. Мол. Pharmacol. 21 , 5–16 (1982).

    CAS PubMed Google Scholar

  • 81

    Нагасаки, К.и другие. In vitro и in vivo антагонисты против белка, связанного с паратиреоидным гормоном.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *